中国大鲵Sox4a、Sox4b、Sox4c及Sox7基因cDNA序列的克隆和组织表达分析

发布时间：2017-04-03 11:02

  本文关键词：中国大鲵Sox4a、Sox4b、Sox4c及Sox7基因cDNA序列的克隆和组织表达分析，，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：Sox (SRY-box containing)基因在动物界广泛存在,目前已在鱼类、两栖类、爬行类、鸟类和哺乳类动物中发现超过100个成员,根据HMG盒的相似性,将其划分为A-K 11个亚族。Sox4基因是SoxC亚族成员之一,在胚胎发育中起着至关重要的作用,主要参与心脏、淋巴细胞、中枢神经系统、内分泌胰岛、造血细胞、性腺等多种器官的发育。Sox7基因属于Sox家族F亚族,主要参与胚胎发育和细胞命运的决定。Sox7基因不仅能够诱导Nodal信号分子、中胚层相关基因以及内胚层分化基因的表达,而且是内胚层Veg-T信号途径所需的标志物。本研究以中国特有的大型珍稀二级保护物种,唯一尚存的隐鳃鲵科两栖动物一中国大鲵(Andrias davidianus)为研究对象,采用逆转录聚合酶链反应(]RT-PCR)及cDNA末端快速扩增(RACE)技术克隆获得中国大鲵Sox4基因的3个同系物：Sox4a、Sox4b、Sox4c及Sox7基因的cDNA序列,对其进行生物信息学分析,并通过荧光定量PCR技术进行各组织间表达情况的分析,主要取得如下结果：1. Sox4a基因的cDNA序列为1153 bp,编码224个氨基酸,位于59-130之间的HMG-box是其主要功能区,同源性分析表明中国大鲵Sox4a编码蛋白与其他物种Sox4a蛋白同源性在63.8%-97.2%之间；对不同物种的Sox4a蛋白构建系统发育树可知：鲤鱼(Cyprinus carpio)与施氏鲟(Acipenser schrenckii)从进化树最先分出,随后两栖类的中国大鲵与饰纹姬蛙(Microhyla ornata)聚成一支,鳙鱼(Hypophthalmichthys nobilis)与斑马鱼(Danio rerio)最后分出,说明Sox4a基因是一个古老的基因,且从中国大鲵到鱼类的进化速度比较快,Sox4a基因的基因复制时间可能在鳙鱼与斑马鱼分化之前。Sox4b基因的cDNA序列为1058 bp,编码193个氨基酸,位于59-130之间的HMG-box是其主要功能区,同源性分析表明中国大鲵Sox4b编码蛋白与其他物种Sox4b蛋白同源性在60.3%-97.1%之间；对不同物种的Sox4b蛋白构建系统发育树可知饰纹姬蛙最早从进化树分出,随后是鲤鱼、瓣结鱼(Folifer brevifilis)等几种鱼类,中国大鲵与金线蛙(Pelophylax plancyi)聚成一支最后从进化树分出。Sox4c基因的cDNA序列为996bp,编码149个氨基酸,位于59-130之间的HMG-box是其主要功能区, Sox4c基因目前仅在饰纹姬蛙获得部分核苷酸片段,将其推导蛋白与中国大鲵Sox4c序列进行比对,两者同源性高达81.7%。2.Sox7基因的cDNA序列长为847bp,编码188个氨基酸,位于44-115之间的HMG-box是其主要功能区,中国大鲵Sox7编码蛋白与其他物种Sox7蛋白同源性在64.1-76.8%之间；对不同物种的Sox7蛋白构建系统发育树可知Sox7基因是一个比较古老的基因,在鱼类、两栖、爬行、哺乳均有存在,中国大鲵与非洲爪蟾、热带爪蟾两栖类聚在一起基本符合物种进化的历程。3.从NCBI下载、查阅文献及本实验室先前所得的中国大鲵Sox基因家族：Sox2、Sox3、Sox4a、Sox4b、Sox4c、Sox7、Sox9、Sox11、Soxl4a、Soxl4b、Sox19共11个成员。利用MEGA 5.0软件,采用邻接法(Neighbor-joining method)重复1000次对这11个Sox基因成员构建系统发育树,结果显示：Sox4a、Sox4b、Sox4c及Soxll汇聚在一起分化出来,显示其较原始的进化地位、Sox9及Sox7聚在一起随后分出,Sox14的2个同系物、Sox2、Sox19及Sox3最后分出。4.利用荧光定量PCR方法分析中国大鲵Sox4和Sox7基因的组织表达情况,结果显示：Sox4基因在性成熟的中国大鲵各组织表达量均比较低,相对而言在肠道表达量最高,心脏、卵巢、垂体的表达量次之,肝脏中的表达量极低,脑及肾脏中几乎不表达。Sox7基因在所有检测的组织中均有表达,且在肾脏中的表达量最高,肠道、心脏、脑以及卵巢的表达量次之,垂体中的表达量较低,肝脏表达量极低。
【关键词】：中国大鲵 Sox4a Sox4b Sox4c Sox7 基因克隆 表达分析
【学位授予单位】：四川农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：Q78;S917.4
【目录】：

• 摘要4-6
• Abstract6-10
• 1 文献综述10-20
• 1.1 Sox基因的概述10
• 1.2 Sox基因的成员与鉴定10-11
• 1.3 Sox基因超家族的特点11-12
• 1.4 Sox基因家族分类及功能12-13
• 1.5 Sox基因超家族的进化13-14
• 1.6 Sox4和Sox7基因的研究进展14-17
• 1.6.1 Sox4基因及其同系物的研究进展14-16
• 1.6.2 Sox7基因的研究进展16-17
• 1.7 研究目的及意义17-20
• 2 材料和方法20-35
• 2.1 实验材料20-22
• 2.1.1 实验动物20
• 2.1.2 实验仪器20
• 2.1.3 试剂及主要试剂的配制20-22
• 2.1.3.1 本研究所用的试剂及菌种20-21
• 2.1.3.2 主要试剂的配制21-22
• 2.2 实验方法22-35
• 2.2.1 中国大鲵总RNA的提取22-23
• 2.2.2 第一链cDNA的合成23-26
• 2.2.2.1 PCR模板的制备23-24
• 2.2.2.2 5’-RACE模板的制备24-25
• 2.2.2.3 3’-RACE模板的制备25-26
• 2.2.3 中国大鲵Sox4基因同系物及Sox7基因保守片段的克隆26-28
• 2.2.3.1 保守引物设计及合成26
• 2.2.3.2 保守序列的合成26
• 2.2.3.3 PCR产物的回收26-27
• 2.2.3.4 PCR扩增产物与T载体连接反应27
• 2.2.3.5 转化及筛选送测27-28
• 2.2.4 中国大鲵Sox4基因同系物及Sox7基因5’-RACE扩增28-30
• 2.2.4.1 5’-RACE引物设计28
• 2.2.4.2 中国大鲵Sox4基因同系物5’-RACE扩增28-29
• 2.2.4.3 中国大鲵Sox7基因5’-RACE扩增29-30
• 2.2.5 中国大鲵Sox4基因同系物及Sox7基因3'-RACE扩增30-32
• 2.2.5.1 3’-RACE引物设计30
• 2.2.5.2 中国大鲵Sox4基因同系物3’-RACE扩增30-31
• 2.2.5.3 中国大鲵Sox7基因3’-RACE扩增31-32
• 2.2.6 序列分析32
• 2.2.7 荧光定量PCR检测中国大鲵Sox4和Sox7基因在各组织中的表达32-35
• 2.2.7.1 荧光定量PCR引物设计32-33
• 2.2.7.2 各组织样品总RNA的提取及cDNA的制备、检测33
• 2.2.7.3 最适退火温度的选择33-34
• 2.2.7.4 标准曲线的制作34
• 2.2.7.5 荧光定量PCR检测Sox4和Sox7基因表达情况34
• 2.2.7.6 数据分析34-35
• 3 结果与分析35-53
• 3.1 中国大鲵总RNA的提取35
• 3.2 中国大鲵Sox4基因同系物保守片段的克隆35-36
• 3.3 中国大鲵Sox4基因同系物cDNA的克隆及序列分析36-45
• 3.3.1 中国大鲵Sox4基因同系物cDNA的克隆36-37
• 3.3.1.1 Sox4基因的5’端cDNA的克隆36
• 3.3.1.2 Sox4基因的3’端cDNA的克隆36-37
• 3.3.2 Sox4a、Sox4b、Sox4c基因的序列分析37-40
• 3.3.3 Sox4同系物蛋白序列比对、同源性分析及系统进化树的构建40-45
• 3.3.3.1 Sox4同系物蛋白序列比对41-42
• 3.3.3.2 Sox4同系物蛋白同源性分析42-44
• 3.3.3.3 Sox4同系物蛋白系统进化树的构建44-45
• 3.4 中国大鲵Sox7基因cDNA的克隆及序列分析45-50
• 3.4.1 S；ox7基因的cDNA的克隆45-46
• 3.4.1.1 Sox7基因的5’端cDNA的克隆45
• 3.4.1.2 Sox7基因的3’端cDNA的克隆45-46
• 3.4.2 Sox7基因的序列分析46-47
• 3.4.3 Sox7蛋白序列比对、同源性分析及系统进化树的构建47-50
• 3.4.3.1 Sox7蛋白序列比对47-48
• 3.4.3.2 Sox7蛋白同源性分析48-49
• 3.4.3.3 Sox7蛋白系统进化树的构建49-50
• 3.5 Sox基因超家族进化关系50-51
• 3.6 中国大鲵Sox4和Sox7基因的组织表达分析51-53
• 3.6.1 荧光定量PCR检测51-52
• 3.6.2 中国大鲵Sox4基因各组织的差异表达结果52
• 3.6.3 中国大鲵Sox7基因各组织的差异表达结果52-53
• 4 讨论53-58
• 4.1 中国大鲵Sox4同系物及Sox7基因的序列分析53-55
• 4.1.1 中国大鲵Sox4a、Sox4b、Sox4c基因的序列分析53-54
• 4.1.2 中国大鲵Sox7基因的序列分析54-55
• 4.2 Sox基因超家族进化关系分析55-56
• 4.3 中国大鲵Sox4、Sox7基因在各组织中的表达分析56-58
• 4.3.1 中国大鲵Sox4基因在各组织中的表达分析56-57
• 4.3.2 中国大鲵Sox7基因在各组织中的表达分析57-58
• 5 结论58-59
• 参考文献59-64
• 致谢64-65
• 攻读学位期间发表的学术论文目录65

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  本文关键词：中国大鲵Sox4a、Sox4b、Sox4c及Sox7基因cDNA序列的克隆和组织表达分析，由笔耕文化传播整理发布。

本文编号：284191