多房棘球蚴Em95基因克

发布时间：2020-10-24 12:52

　　 多房棘球蚴病俗称泡球蚴病是由多房棘球绦虫的幼虫(多房棘球蚴、泡球蚴)寄生于人或动物肝脏所引起的一种人兽共患寄生虫病,它的成虫主要寄生于狐狸、狼和犬的小肠内。本病主要在北半球高纬度地区和冻土地带流行,但随着世界贸易和全球化进程的推进,该病有向南半球蔓延的趋势。它不仅能严重危害人体的健康,而且还是一个严重的社会经济问题。目前,对于该病的治疗主要是以手术切除为主,药物治疗为辅,但是由于泡球蚴呈肿瘤样无限浸润生长,手术切除后能发生转移,因此对泡球蚴病的预防成为流行区各级政府所优先关心的问题。研究多房棘球绦虫保护性抗原EM95的免疫保护作用对泡球蚴病疫苗研制与开发具有十分重要的意义。本研究以NCBI数据库Em95基因序列作为参考序列设计引物,以多房棘球蚴总RNA反转录产物为模板进行PCR扩增,获得Em95基因完整ORF序列,并对该序列进行了相关的生物信息学分析。结果表明,EM95蛋白的编码基因长471 bp,与参考序列的相似性为100%,由156个氨基酸残基组成,其上有2个N-糖基化位点,N端有一长为16个氨基酸的信号肽序列,C端有由23个氨基酸组成的跨膜区,属于分泌型糖蛋白。B细胞抗原表位分析表明,EM95有6个潜在的抗原表位,比EG95预测的抗原表位少一个。将全长的Em95基因和截去编码信号肽及跨膜区的Em95基因分别克隆到原核表达载体中并转化到大肠杆菌Rosetta感受态细胞中,用IPTG诱导使其表达。结果表明,全长的Em95基因以包涵体形式表达,而截去信号肽及跨膜区的Em95基因(t Em95)以可溶性蛋白形式表达。将纯化后的tEM95重组蛋白免疫BALB/c小鼠(雌性,6周龄),小鼠分为免疫组(首免50μg,以后减半,40只)、佐剂组(40只)和对照组(40只),三次免疫两周后腹腔接种多房棘球蚴原头蚴(100个/只)进行攻击感染,9周后对试验小鼠进行剖检,结果表明EM95重组蛋白对小鼠的保护率为27.58%,减蚴率为60.52%~67.38%。结论认为,EM95重组蛋白对继发性多房棘球蚴病具有一定的保护作用,能明显抑制多房棘球蚴的生长;本研究为多房棘球蚴病EM95重组抗原疫苗的研制和开发提供了理论依据。
【学位单位】：中国农业科学院
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2015
【中图分类】：S852.7;Q78
【文章目录】：
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摘要
Abstract
英文缩略表
第一章 前言
    1.1 包虫病/棘球绦虫
    1.2 泡型包虫病/多房棘球蚴
    1.3 EG95/EM95
第二章 多房棘球绦虫Em95基因克隆及序列分析
    2.1 材料与方法
        2.1.1 多房棘球蚴、菌种及试剂
        2.1.2 引物设计与合成
        2.1.3 多房棘球蚴的获取
        2.1.4 原头蚴总RNA提取与反转录
        2.1.5 PCR扩增多房棘球蚴Em95基因
        2.1.6 Em95基因的克隆及测序
        2.1.7 Em95基因序列分析
    2.2 结果
        2.2.1 多房棘球蚴总RNA的提取
        2.2.2 多房棘球绦虫Em95基因的克隆
        2.2.3 EM95理化性质
        2.2.4 EM95信号肽及跨膜区预测
        2.2.5 EM95二级结构分析
        2.2.6 抗原表位预测
        2.2.7 三级结构预测
    2.3 讨论
第三章 多房棘球绦虫Em95基因原核表达载体的构建及表达
    3.1 实验材料
        3.1.1 载体与菌株
        3.1.2 主要试剂
        3.1.3 主要仪器
    3.2 实验方法
        3.2.1 重组质粒的构建及鉴定
        3.2.2 多房棘球蚴EM95的原核表达及表达形式鉴定
        3.2.3 表达条件优化
        3.2.4 重组EM95蛋白纯化
    3.3 结果
        3.3.1 Em95基因片段的扩增
        3.3.2 重组质粒阳性鉴定（PCR）
        3.3.3 Em95和tEm95原核表达
        3.3.4 pET30a-tEm95重组蛋白诱导条件的优化
        3.3.5 pET30a-tEm95重组蛋白的纯化
    3.4 讨论
第四章 重组EM95蛋白免疫小鼠保护力观察及应用
    4.1 材料与方法
        4.1.1 实验动物、多房棘球蚴及样品
        4.1.2 主要试剂及溶液
        4.1.3 小鼠的免疫实验
        4.1.4 ELISA检测EM95特异性抗体检测
        4.1.5 EM95重组蛋白保护效力观察
        4.1.6 EM95重组蛋白的应用
    4.2 结果
        4.2.1 ELISA检测
        4.2.2 攻虫实验
        4.2.3 EM95重组蛋白保护力检测
        4.2.4 EM95重组蛋白的应用
    4.3 讨论
第五章 全文结论
参考文献
致谢
作者简历

【参考文献】

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本文编号：2854492