猪繁殖与呼吸综合征病毒RNA与非结构蛋白互作的研究及nsp12多克隆抗体的制备

发布时间：2017-04-06 10:11

  本文关键词：猪繁殖与呼吸综合征病毒RNA与非结构蛋白互作的研究及nsp12多克隆抗体的制备，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：猪繁殖与呼吸综合征是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)感染引起的,给养猪产业带来了经济上毁灭性的灾难。近几年来,我们对该病毒编码的结构蛋白功能已有了突破性的认知,但有关非结构蛋白功能还了解很少。FL12质粒包含PRRSV NVSL#97-7895毒株基因组全长cDNA。本文以FL12质粒为模板,通过构建pTriEx-nsp12表达载体,大量表达病毒非结构蛋白nsp12(nsp,nonstructural protein),经Ni2+亲和层析获得高纯度蛋白,作为制备抗血清的抗原。实验遵照适合的免疫流程免疫家兔,制备nsp12抗血清。斑点杂交和Western印迹实验检测结果显示我们获得了nsp12的高效价抗体,并且可以检测到nsp12在PRRSV感染的MARC145细胞(非洲绿猴肾细胞MA104派生细胞系)中的表达。同时显微镜观察pTriEx-nsp12-GFP质粒在293T(人胚肾细胞派生细胞系)及MARC145细胞中的表达定位情况发现,nsp12主要分布在细胞质的部分区域,可能定位于某些细胞器。在对PRRSV反向遗传系统构建过程中,我们采用两条策略构建感染型的cDNA克隆。pTriEx-FL12质粒包含NVSL#97-7895毒株基因组全长cDNA,克隆在pTriEx1.1载体上。pTriExHH-FL12质粒构建方法和pTriEx-FL12质粒类似,但PRRSV cDNA侧翼添加了核酶序列。遗憾的是,两种方法构建的质粒经转染均没有包装得到病毒。通过对两个改造的质粒骨架pTriExHH-linker和pTriEx-linker研究分析发现,缺失5’非翻译区的质粒不影响蛋白表达过程中mRNA的转录,但在多克隆位点插入核酶DNA序列后,由于转录后产物的自我剪切作用,蛋白表达量下降。即改造质粒可以在细胞内正常转录并发挥核酶的功能。由于设计上的缺陷,即使核酶存在的载体在PRRSV的cDNA转录后,3’非翻译区仍然存在少量冗余核苷酸,我们分析这些多余的核苷酸可能影响RdRp(RNA-dependent RNA polymerase)的结合,阻碍病毒复制。除此之外,MARC145细胞转染效率低,也可能导致病毒的包装效率降低,无法观察到细胞病变现象。动脉炎病毒基因组5’和3’非翻译区在病毒复制过程中非常重要,例如结合病毒RNA的聚合酶,解旋酶等。因此,实验采用体外转录的方法研究5’和3’非翻译区同非结构蛋白之间的互作情况,通过凝胶阻滞电泳确定结合反应是否发生。其中结构蛋白N是PRRSV核衣壳组分,已经确认可以结合病毒RNA,但本实验使用的N蛋白可能由于GST标签的空间位阻效应,阻碍N-GST融合蛋白同RNA结合。nsp9存在RdRp结构域,已经确认能够识别并结合病毒基因组侧翼非翻译区,凝胶阻滞电泳也显示出其有结合活性。nsp8为病毒ORF1a编码的最后一个蛋白,实验发现,加入该蛋白的实验组无论同病毒3’端还是5’端RNA作用,均会导致RNA快速降解,这是一个新颖的发现,推测nsp8可能具有RNA酶活性。另外,nsp7和nsp12蛋白没有发现结合活性。
【关键词】：PRRSV 非结构蛋白 多克隆抗体 反向遗传系统
【学位授予单位】：西北农林科技大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S852.651
【目录】：

• 中文摘要5-7
• abstract7-12
• 第一章 文献综述12-22
• 1.1 PRRSV概论12
• 1.2 PRRSV的基因组结构12-18
• 1.2.1 非结构蛋白的种类和功能14-16
• 1.2.2 结构蛋白的种类和功能16-18
• 1.3 PRRSV复制过程18-19
• 1.4 合成病毒学的发展与应用19-21
• 1.5 本论文研究的目的及意义21-22
• 第二章 PRRSVnsp12基因的克隆表达与多克隆抗体的制备22-33
• 2.1 材料与试剂22
• 2.1.1 工程菌株和质粒载体22
• 2.1.2 器材与试剂22
• 2.2 实验方法步骤22-26
• 2.2.1 pTriEx-nsp12载体的构建22-23
• 2.2.2 nsp12蛋白表达条件优化23-24
• 2.2.3 nsp12的纯化24
• 2.2.4 nsp12多克隆抗体的制备24-25
• 2.2.5 斑点杂交对抗血清效价的初步检测25
• 2.2.6 Western Blot检测nsp12原核表达25
• 2.2.7 Western Blot检测nsp12在PRRSV感染的MARC145细胞中的表达25
• 2.2.8 融合蛋白nsp12-GFP亚细胞定位25-26
• 2.3 结果与分析26-31
• 2.3.1 pTriEx-nsp12质粒的构建26
• 2.3.2 nsp12蛋白表达纯化26-28
• 2.3.3 免疫血清的检测28-29
• 2.3.4 Western Blot检测nsp12原核表达29-30
• 2.3.5 pTriEx-nsp12-GFP亚细胞定位30
• 2.3.6 nsp12在PRRSV感染的MARC145细胞中的表达30-31
• 2.4 讨论31-33
• 第三章 PRRSV反向遗传系统及致弱病毒感染型cDNA克隆的构建33-39
• 3.1 材料与试剂33
• 3.1.1 工程菌株和质粒载体33
• 3.1.2 器材与试剂33
• 3.2 实验方法步骤33-36
• 3.2.1 感染型cDNA克隆的构建33-36
• 3.2.2 感染型cDNA克隆转染MARC145细胞包装病毒36
• 3.3 结果与分析36-38
• 3.3.1 质粒pTriEx-FL12的构建36-38
• 3.3.2 质粒pTriEx-FL12Δ 的构建38
• 3.3.3 pTriEx-FL12和pTriEx-FL12Δ 转染MARC145细胞38
• 3.4 讨论38-39
• 第四章 带有核酶序列的病毒感染型cDNA克隆的构建39-45
• 4.1 材料与试剂39
• 4.1.1 工程菌株和质粒载体39
• 4.1.2 器材与试剂39
• 4.2 实验方法步骤39-41
• 4.2.1 pTriExHH-FL12质粒的构建39-41
• 4.2.2 pTriExHH-FL12转染MARC145细胞包装病毒41
• 4.2.3 pTri ExHH-linker-GFP和pTriEx-linker-GFP载体的构建和转染细胞的GFP荧光检测41
• 4.3 结果与分析41-43
• 4.3.1 质粒pTriExHH-linker的构建41-42
• 4.3.2 质粒pTriExHH-FL12的构建42
• 4.3.3 pTriExHH-FL12转染MARC145细胞包装病毒42
• 4.3.4 pTriExHH-linker-GFP和pTriEx-linker-GFP质粒真核细胞表达GFP显微观察42-43
• 4.4 讨论43-45
• 第五章 PRRSV5’UTR和 3’UTR与非结构蛋白之间的互作45-50
• 5.1 材料与试剂45
• 5.1.1 工程菌株和质粒载体45
• 5.1.2 器材与试剂45
• 5.2 实验方法步骤45-47
• 5.2.1 PRRSV3’非翻译区质粒载体的构建45-46
• 5.2.2 非结构蛋白表达纯化46
• 5.2.3 PRRSV的 5’和 3’非翻译区同非结构蛋白的互作46-47
• 5.3 结果与分析47-48
• 5.3.1 非结构蛋白表达纯化47
• 5.3.2 pTriEx-3EMSA质粒载体的构建47-48
• 5.3.3 凝胶阻滞电泳检测PRRSV 5’和 3’非翻译区同非结构蛋白的互作48
• 5.4 讨论48-50
• 结论50-51
• 参考文献51-60
• 附录 160-61
• 附录 261-63
• 附录 363-64
• 致谢64-65
• 作者简介65

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