甘蔗受黑穗病菌胁迫下microRNA差异表达及其靶基因功能分析

发布时间：2017-04-07 12:02

  本文关键词：甘蔗受黑穗病菌胁迫下microRNA差异表达及其靶基因功能分析，，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：甘蔗(Saccharum spp.)是我国最重要的糖料作物和能源作物,蔗糖占我国食糖总产的92%。由黑粉菌(Sporisorium scitamineum, S. scitamineum)引起的甘蔗黑穗病(sugarcane smut),严重危害甘蔗生产,导致产量和蔗糖分降低,给我国甘蔗产业造成了巨大的经济损失。培育抗黑穗病甘蔗品种是控制甘蔗黑穗病危害的最经济有效的手段。植物与病原互作的分子机制包括转录水平、转录后水平、翻译水平、翻译后水平等多方面调控机制。随着生物技术的发展,有关甘蔗与黑穗病菌互作分子机制的研究有了长足进步,但是尚未见利用高通量测序技术鉴定甘蔗受黑穗病菌胁迫后microRNA (miRNA)差异表达及其靶标基因预测和功能分析的报道。本研究首次利用高通量测序技术鉴定甘蔗受黑穗病菌胁迫下miRNA的差异表达,从甘蔗小RNA高通量测序与niRNA鉴定注释、差异miRNA筛选和实时荧光定量PCR技术(qRT-PCR)表达验证与表达模式分析、差异miRNA的功能分析及其靶基因预测和靶基因表达分析等三个方面入手,系统比较了甘蔗与黑穗病菌互作系统的亲和与不亲和互作间在转录后水平上miRNA的调控机制,以期为甘蔗抗黑穗病分子机理的研究提供niRNA水平的佐证,丰富和深化甘蔗抗黑穗病的分子机理研究,进而为培育抗黑穗病甘蔗品种提供miRNA水平的理论依据。miRNA具有重要的生物学功能,在植物受到生物和非生物胁迫的过程中发挥重要调控作用,其介导的转录后水平的基因调控是生物体内一条重要的小RNA调控路径。本研究以甘蔗抗黑穗病无性系崖城05-179 (YA05-179)和感黑穗病甘蔗品种新台糖22 (ROC22)为研究材料,以接种黑穗病菌蔗芽作为处理组(YAT、RT),接种清水作为对照组(YACK、RCK),应用高通量HiSeq测序技术鉴定甘蔗受黑穗病胁迫下48h的miRNA差异表达,对所获得的小RNA序列注释并筛选出差异表达的miRNA,利用生物信息学技术与数据库结合对其靶向基因进行预测。实验对筛选出的部分差异miRNA进行实时定量验证,并进一步分析了甘蔗与黑穗病菌互作Oh、12h、48h和96h不同时间点miRNA与其部分靶基因的表达模式。研究旨在找到甘蔗在黑穗病菌胁迫下发挥关键调控作用的miRNA及其靶基因,为甘蔗抗黑穗病分子育种提供miRNA和基因资源。主要研究结果如下：1.四个甘蔗样品的送样质量良好,分别测序得到符合要求的干净序列为RCK 36396588条、RT27812972条、YACK 27464468条、YAT 28290231条,且杂质序列含量都少于1%,故高通量测序获得的小RNA质量高。结合多个数据库对测得的sRNAs进行筛选注释,其中RCK测序获得264个已知miRNA,RT有263个,YACK有260个,YAT有262个。此外,在RCK、RT、YACK和YAT中分别预测出137、140、111和119个新miRNA。有碱基分布统计分析结果显示,四个小RNA文库中在植物中含量较多的长度为21 nt和22 nt的新niRNA序列首位点碱基U所占比例较大；在序列碱基11位点,四个样品的新miRNA序列的碱基都偏向于A,符合miRNA序列特征,说明新miRNA序列的预测结果可行性高。2.在ROC22中,筛选出231个已知miRNA,其中35个在黑穗病菌胁迫处理样品和清水接种对照样品间发生显著差异表达(|log2一ratio|1,P0.05)；涉及10个上调表达和25个下调表达的miRNA:在对照组与处理组样品中表达量差异倍数最高达4.6倍。在YA05-179中,两个样品中共有的已知miRNA为208个,对照组与处理组中发生显著差异表达niRNA有11个；涉及2个上调表达和9个下调表达的miRNA:对照组与处理组样品中表达量差异倍数最高达2.1倍。在ROC22和YA05-179中,筛选出的差异表达的已知miRNA,下调表达的占多数,且大部分miRNA的种类和表达趋势是相同的。在ROC22中,筛选出的显著差异表达(|log2-ratio|1,P0.05)的新miRNA有16个,而YA05-179中有6个；其在单一品种特有的比较多,且在两个品种中没有发现共同显著差异表达的新miRNA。本研究针对筛选出的16个差异表达的已知miRNA和新miRNA,利用qRT-PCR对其在ROC22与YA05-179两个品种中27个表达结果进行测序结果验证,相符率达到了85.2%,可见本研究的测序结果可靠性较高。3.甘蔗是个高度杂合的异源多倍非整倍体作物,其全基因组测序尚未完成,因此本研究注释的miRNA未知序列占小RNA序列的绝大多数,随后对所注释的miRNA在甘蔗受黑穗病菌胁迫时对应靶基因的预测及分析数据也不完整。差异表达的已知miRNA预测出的靶基因数,YA05-179少于ROC22,但差异表达的新miRNA对应的靶基因数目在YA05-179中明显多于R022。靶基因生物功能分析中,GO归类为生物过程(biological process)、细胞组分和元件(cellular components)分子功能(molecular function)。两个品种中,差异表达的已知miRNA靶基因的分类情况与差异表达的新miRNA所匹配的靶基因序列统计情况相似,即在生物过程分类中靶基因主要分布在细胞过程与代谢过程,细胞组分和元件分类中靶基因主要分布在细胞、细胞组分和细胞器中,分子功能分类中靶基因主要分布在结合与催化活性。KEGG通路富集分析显示,差异miRNA调控的靶基因参与了一系列miRNA调控靶基因生理生化途径或抗病相关生理代谢和信号转导途径,表明甘蔗与黑穗病菌互作的分子机制是一个复杂网络调控系统。研究发现,miR5077、 miR5671、miR5044、miR5261、miR5783、miR5221、miR6478和miR948的靶向基因在MAPK信号通路(MAPK signaling pathway)、植物激素信号转导(Plant hormone signal transduction)和植物-病原菌互作 (Plant-pathogen interaction)中发挥重要作用并构建了相关蛋白网络调控图。4.从miRNA靶基因中筛选了在甘蔗EST文库中有生物功能注释的序列,并针对所筛选出的差异表达的已知miRNA和新miRNA所对应的部分靶基因进行了qRT-PCR表达分析。结果显示,在已知miRNA与其靶基因的表达分析中,大部分miRNA与其靶基因呈负调控模式,即niRNA过表达时,靶基因的表达量呈下降趋势；其中8个靶基因中有7个靶基因的表达在12h后基本相符,且在48h时匹配度最高。这也从另一方面说明甘蔗受黑穗病菌胁迫后miRNA对靶基因的调控作用在48h达到最高。研究还揭示,本研究中已知miRNA与靶基因表达丰度预测与功能分析的可靠性高,但在候选的新miRNA及其靶基因定量表达结果之间的负调控趋势的符合率就没有那么高,故还需对新miRN A的预测与分析作进一步的挖掘。
【关键词】：甘蔗黑穗病 高通量测序 miRNA差异表达 靶基因功能预测 实时荧光定量PCR
【学位授予单位】：福建农林大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S435.661
【目录】：

• 摘要8-10
• Abstract10-13
• 第一章 综述13-22
• 1 甘蔗与黑穗病菌互作的研究现状13-16
• 1.1 甘蔗黑穗病13-14
• 1.2 甘蔗品种抗黑穗病性的形态和生理生化机理研究14
• 1.3 甘蔗品种抗黑穗病性的分子机理研究14-16
• 2 植物miRNA研究概况16-19
• 2.1 miRNA的发现16-17
• 2.2 miRNA的起源、加工与合成17
• 2.3 miRNA的命名规则17
• 2.4 miRNA的作用机制17-18
• 2.5 miRNA与植物的生长发育18
• 2.6 miRNA与植物激素的调节及信号转导18-19
• 2.7 miRNA与植物生物和非生物胁迫19
• 3 植物miRNA的获得与检测19-20
• 4 研究背景、目的与意义20-21
• 5 技术路线21-22
• 第二章 甘蔗小RNA高通量测序和miRNA的鉴定与注释22-39
• 1 实验材料22-23
• 1.1 甘蔗黑穗病菌孢子收集22
• 1.2 植物材料及处理22-23
• 1.3. 主要试剂23
• 1.4 主要仪器设备23
• 1.5 主要使用的数据库23
• 2 实验方法23-25
• 2.1 总RNA提取23
• 2.2 总RNA质量检测23-24
• 2.2.1 琼脂糖凝胶电泳检测24
• 2.2.2 酶标仪与Agilent 2100检测24
• 2.3 HiSeq测序24-25
• 3 结果与分析25-37
• 3.1 总RNA质量检测25-26
• 3.1.1 琼脂糖凝胶电泳检测25-26
• 3.1.2 酶标仪与Agilent 2100检测26
• 3.2 测得小RNA数据的评估26-28
• 3.2.1 测得小RNA数据质量26-27
• 3.2.2 小RNA序列长度分布27
• 3.2.3 样品间小RNA公共及特有序列分析27-28
• 3.3 小RNA序列的清理28-30
• 3.3.1 小RNA与重复序列的比对28-29
• 3.3.2 小RNA序列与GenBank数据库比对结果29-30
• 3.3.3 小RNA序列与Rfam数据库比对结果30
• 3.4 小RNA的分类注释30-32
• 3.5 已知miRNA表达谱信息32-33
• 3.6 新miRNA预测信息统计33-37
• 3.6.1 新miRNA筛选33-35
• 3.6.2 新miRNA的碱基分布统计35-37
• 3.6.2.1 新miRNA的首位点碱基分布35-36
• 3.6.2.2 新miRNA各位点碱基分布36-37
• 4 讨论37-39
• 第三章 差异miRNA的筛选及其qRT-PCR表达分析39-57
• 1 实验材料39
• 1.1 植物材料及处理39
• 1.2 主要试剂39
• 1.3 主要仪器设备39
• 2 实验方法39-42
• 2.1 不同样本中差异表达miRNA的筛选及其表达模式聚类分析39-40
• 2.1.1 差异表达miRNA筛选39-40
• 2.1.2 差异表达miRNA的表达模式聚类分析40
• 2.2 实时荧光定量(qRT-PCR)表达验证40-42
• 2.2.1 总RNA提取与检测40
• 2.2.2 引物设计40-41
• 2.2.3 反转录41-42
• 2.2.4 qRT-PCR表达分析42
• 2.3 miRNA的表达模式分析42
• 3 结果与分析42-55
• 3.1 不同样本中差异表达的已知miRNA筛选42-47
• 3.1.1 已知miRNA的差异表达分析42-45
• 3.1.2 已知miRNA的表达模式聚类分析45-47
• 3.2 不同样本中差异表达的新miRNA筛选47-49
• 3.2.1 新miRNA的差异表达分析47-48
• 3.2.2 新miRNA的表达模式聚类分析48-49
• 3.3 miRNA表达的qRT-PCR验证49-52
• 3.3.1 miRNA和内参基因的溶解曲线49-51
• 3.3.2 qRT-PCR表达验证51-52
• 3.4 miRNA的表达模式分析52-55
• 4 讨论55-57
• 第四章 差异miRNA的功能分析和靶基因预测及其表达分析57-80
• 1 实验材料57-58
• 1.1 植物材料及处理57
• 1.2 主要试剂与仪器57
• 1.3 数据库57-58
• 2 实验方法58-60
• 2.1 miRNA靶基因预测58
• 2.2 GO富集分析58-59
• 2.3 KEGG通路分析59
• 2.4 靶基因的qRT-PCR表达分析59-60
• 2.4.1 总RNA提取与检测59
• 2.4.2 引物设计59-60
• 2.4.3 反转录60
• 2.4.4 qRT-PCR表达分析60
• 3 结果与分析60-75
• 3.1 miRNA靶基因的预测60-62
• 3.2 GO分析62-69
• 3.2.1 已知miRNA靶基因的GO分析62-66
• 3.2.1.1 GO富集倍数分析62-65
• 3.2.1.2 靶基因的种类和分布65-66
• 3.2.2 新miRNA靶基因的GO分析66-69
• 3.2.2.1 GO富集倍数分析66-67
• 3.2.2.2 靶基因的种类和分布67-69
• 3.3 KEGG分析69-71
• 3.3.1 已知miRNA靶基因的KEGG分析69-70
• 3.3.2 新miRNA靶基因的KEGG分析70-71
• 3.4 靶基因的qRT-PCR表达分析71-75
• 3.4.1 靶基因和内参基因的溶解曲线71-73
• 3.4.2 qRT-PCR表达分析73-75
• 4 讨论75-80
• 4.1 靶基因的预测与功能注释75-76
• 4.2 抗性相关代谢途径分析76-79
• 4.2.1 植物MAPK信号途径76-77
• 4.2.2 植物激素信号转导途径77
• 4.2.3 植物与病原菌互作途径77-79
• 4.3 部分靶基因的qRT-PCR表达分析79-80
• 第五章 结论与展望80-82
• 5.1 结论80-81
• 5.2 创新点与后续工作展望81-82
• 参考文献82-90
• 致谢90

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