猪轮状病毒的分离鉴定及其环介导等温扩增反应检测方法的建立

发布时间：2017-04-08 06:09

  本文关键词：猪轮状病毒的分离鉴定及其环介导等温扩增反应检测方法的建立，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：轮状病毒(Rotavirus)作为一种重要的肠道微生物,能造成多种小动物和新生婴幼儿腹泻。PoRV与PEDV、TGEV并称为引起腹泻的三大病毒。目前,在世界上许多国家和地区均发现轮状病毒可引起相关腹泻疾病,对农业带来了巨大的经济损失。本实验室自2013年到2014年,在全国不同省市和地区采集腹泻样品362份,进行流行病学调查,检测结果显示,362份样品中,PEDV的阳性样品数为223份,阳性率为61.6%,TGEV的阳性样品数为2份,阳性率为0.55%;PoRV的阳性样品数为8份,阳性率为2.2%;PKV的阳性样品数为66份,阳性率为18.23%。将来自江苏省某发病猪场的轮状病毒阳性样品处理并与20ug/mL胰酶等体积混合后接种至MA-104细胞上,盲传8代,细胞出现变圆、拉网、脱落等病变。PCR及测序结果显示为猪轮状病毒,命名为JS株。三次蚀斑克隆纯化后测定TCID50为10-6.875/mL,中和试验用病毒的最佳稀释倍数为150倍,并建立抗体检测方法。JS分离株的VP4基因型与P[7]基因型同源性最高,VP7基因型与G[9]基因型同源性最高。根据A群轮状病毒最新分类方法,JS分离株属于P[7]G[9]型。采用环介导等温扩增技术,建立了一种快速检测轮状病毒的实验方法。结果显示,当反应体系中甜菜碱浓度为0.8M,镁离子浓度为2mM,最佳反应温度为63℃时反应60min,扩增可达最佳效果。且该方法特异性良好,灵敏度为RT-PCR的100倍。可用于现场检测,具有良好的应用前景。
【关键词】：猪轮状病毒 流行病学调查 分离 鉴定 环介导等温扩增
【学位授予单位】：中国农业科学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S852.65
【目录】：

• 摘要5-6
• ABSTRACT6-12
• 中英文缩略表12-13
• 第一章 引言13-22
• 1.1 病原学13-14
• 1.2 流行病学14-15
• 1.3 临床症状15
• 1.4 病理变化15-16
• 1.5 基因组学研究进展16-18
• 1.6 轮状病毒检测方法的研究进展18-20
• 1.6.1 免疫学方法18-19
• 1.6.2 分子生物学技术19-20
• 1.7 轮状病毒的疫苗研究进展20-22
• 1.7.1 灭活苗20
• 1.7.2 弱毒活疫苗20
• 1.7.3 多价重配疫苗20-21
• 1.7.4 基因工程疫苗21
• 1.7.5 植物基因工程技术21-22
• 第二章 猪腹泻病毒的流行病学调查22-30
• 摘要22
• 2.1 实验材料22
• 2.2 物品准备22-23
• 2.3 实验仪器及试剂23
• 2.4 实验方法23-28
• 2.4.1 样品采集23-24
• 2.4.2 无害化处理24
• 2.4.3 样品保存24
• 2.4.4 样品编号、采样单填写24
• 2.4.5 样品处理24-25
• 2.4.6 腹泻四联引物设计25
• 2.4.7 RT-PCR检测25-26
• 2.4.8 PCR的扩增26-27
• 2.4.9 琼脂糖凝胶电泳27-28
• 2.5 结果与分析28-30
• 2.5.1 PCR检测结果28
• 2.5.2 讨论28-30
• 第三章 猪轮状病毒的分离与鉴定30-47
• 摘要30
• 3.1 实验材料30
• 3.2 实验仪器及试剂30-31
• 3.3 病料的接种31
• 3.4 引物设计31
• 3.5 病毒RNA提取、反转录、PCR31-32
• 3.6 感受态的制备32
• 3.7 PMD-18T-VP4、PMD-18T-VP7阳性质粒的构建与鉴定32
• 3.8 猪轮状病毒蚀斑克隆纯化32-33
• 3.9 猪轮状病毒TCID50的测定33-34
• 3.9.1 细胞制备33
• 3.9.2 滴定33-34
• 3.9.3 接种34
• 3.9.4 计算感染量34
• 3.10 猪轮状病毒抗体检测方法的建立34-35
• 3.10.1 猪轮状病毒中和试验用病毒的制备34-35
• 3.10.2 猪轮状病毒抗体检测（中和试验）35
• 3.11 结果35-46
• 3.11.1 猪轮状病毒分离与鉴定35-37
• 3.11.2 PMD-18T-VP4、PMD-18T-VP7重组质粒的PCR鉴定结果37-38
• 3.11.3 JS分离株VP4基因型别分析38
• 3.11.4 JS分离株VP7基因型别分析38-41
• 3.11.5 猪轮状病毒的噬斑克隆纯化41-42
• 3.11.6 TCID50测定42-43
• 3.11.7 猪轮状病毒抗体检测方法的建立43-46
• 3.12 讨论46-47
• 第四章 猪轮状病毒LAMP检测方法的建立47-54
• 摘要47-48
• 4.1 材料48
• 4.1.1 试验用毒株48
• 4.1.2 主要仪器48
• 4.1.3 主要试剂48
• 4.2 试验方法48-50
• 4.2.1 猪轮状病毒JS分离株RNA的提取48
• 4.2.2 病毒cDNA的制备48
• 4.2.3 LAMP引物的设计48-49
• 4.2.4 LAMP反应体系的建立49-50
• 4.3 结果50-53
• 4.3.1 最佳甜菜碱浓度的摸索50
• 4.3.2 最佳Mg2+浓度的摸索50-51
• 4.3.3 最佳反应温度的摸索51
• 4.3.4 LAMP扩增产物的序列测定51
• 4.3.5 LAMP引物特异性检测51-52
• 4.3.6 LAMP引物灵敏性检测52
• 4.3.7 临床样本检测52-53
• 4.4 讨论53-54
• 第五章 结论54-55
• 参考文献55-61
• 附录61-65
• 致谢65-66
• 作者简介66

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前1条

1 高华英;孟红;;VP7、VP4与轮状病毒装配及分子流行病学[J];国际流行病学传染病学杂志;2006年02期

中国硕士学位论文全文数据库 前1条

1 吴奇英;猪轮状病毒TaqMan荧光定量RT-PCR方法的建立及初步应用[D];华中农业大学;2013年

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本文编号：292224