羊种布鲁氏菌对巨噬细胞MHC II表达和递呈的影响

发布时间：2017-04-09 05:18

  本文关键词：羊种布鲁氏菌对巨噬细胞MHC II表达和递呈的影响，，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：布鲁氏菌病(Brucellosis,简称布病)是由布鲁氏菌属(Brucella)的布鲁氏菌引起的一种古老的人畜共患传染病病,该病在世界范围内广泛流行,严重危害公共卫生安全,并造成畜牧业经济巨大损失。巨噬细胞是布鲁氏菌感染宿主后的首要靶细胞,巨噬细胞不仅是宿主体内重要的免疫细胞,也是一种重要的抗原递呈细胞,在清除病原菌、分泌多种细胞因子和对抗原的识别、活化以及免疫调节中扮演着重要的角色,国内外己经有一些研究表明布鲁氏菌感染宿主后具有明显的免疫抑制作用,能够抑制MHC II分子的功能,然而,其相关原因尚不明确。本文主要研究布鲁氏菌侵染巨噬细胞后引起的非典型自噬对MHC II类分子的影响以及布鲁氏菌诱导非典型自噬的可能因素,为研究布鲁氏菌免疫抑制提供新的思路和方法。1.布鲁氏菌16M诱导的非典型自噬对巨噬细胞MHC II表达和递呈的影响。以0.25ng/m L IFN-γ处理的小鼠巨噬细胞、布鲁氏菌16M侵染0.25 ng/m L IFN-γ处理的小鼠巨噬细胞为实验组,以未处理细胞为对照组,分别作用0 h、4 h、12 h、24 h,实时荧光定量PCR检测胞内MHC II类分子的转录水平;以布鲁氏菌16M侵染0.25 ng/m L IFN-γ处理过的小鼠巨噬细胞,16M侵染0.25 ng/m L IFN-γ处理的稳定表达Atg5、Atg7的GFP-LC3小鼠巨噬细胞为实验组,转染空质粒的GFP-LC3小鼠巨噬细胞为对照组,实时荧光定量PCR检测细胞内MHC II转录水平,激光共聚焦检测细胞内自噬小体和溶酶体的融合率,流式细胞技术检测细胞表面MHC II类分子平均荧光强度和OMP31平均荧光强度。结果,与0.25 ng/m L IFN-γ处理组相比,布鲁氏菌16M侵染0.25 ng/m L IFN-γ处理的GFP-LC3小鼠巨噬细胞,MHC II分子m RNA水平极显著下降(p0.01);布鲁氏菌侵染稳定表达Atg5和Atg7的GFP-LC3小鼠巨噬细胞后,细胞内MHC II类分子m RNA水平差异不显著(p0.05),但自噬小体和溶酶体的融合率升高,细胞表面MHC II类分子表达量显著升高(p0.01)且对OMP31递呈能力显著升高(p0.01)。实验结果表明布鲁氏菌16M抑制了IFN-γ诱导的MHC II m RNA表达水平;GFP-LC3小鼠巨噬细胞稳定表达自噬相关蛋白Atg5和Atg7,没有改变布鲁氏菌16M对MHC II m RNA的抑制作用,但解除了布鲁氏菌16M对自噬-溶酶体降解途径的阻滞作用,并且显著提高了细胞表面MHC II类分子的表达量和细胞递呈能力。2.布鲁氏菌16M感染巨噬细胞诱导非典型自噬的可能影响因素。以布鲁氏菌16M侵染小鼠巨噬细胞为实验组,未做任何处理的小鼠巨噬细胞为对照组,4 h、12 h、24 h、48h后,通过ELISA抗体双夹心方法检测小鼠巨噬细胞上清液中IL-6的含量;以布鲁氏菌16M侵染0.25 ng/m L IFN-γ处理的GFP-LC3小鼠巨噬细胞、5 ng/m L IL-6和0.25ng/m L IFN-γ处理的GFP-LC3小鼠巨噬细胞、5 ng/m L IL-6处理的GFP-LC3小鼠巨噬细胞为实验组,以布鲁氏菌16M侵染未做任何处理的GFP-LC3小鼠巨噬细胞为对照组,作用4 h,激光共聚焦观察自噬小体标志性蛋白LC3的荧光颗粒;0.25 ng/m L IFN-γ、5ng/m L IL-6分别作用于小鼠巨噬细胞0 min、15 min、30 min、60 min,及0.25 ng/m L IFN-γ和5 ng/m L IL-6共同作用于小鼠巨噬细胞4 h,相对荧光定量PCR检测自噬相关蛋白Atg5和Atg7的表达量。结果布鲁氏菌强毒株16M侵染小鼠巨噬细胞,IL-6细胞因子表达量相比对照组显著升高(p0.01);且激光共聚焦检测到IFN-γ处理过的小鼠巨噬细胞自噬特异性标签GFP-LC3的荧光颗粒数最多,当IFN-γ的处理中同时加入IL-6时,GFP-LC3的荧光颗粒数减少;相对荧光定量PCR显示随时间增加,IFN-γ上调了Atg7的表达量,当作用30 min时差异显著(P0.05),作用60 min时差异极显著(P0.01),IFN-γ对Atg5的表达量没有影响(P0.05),而IL-6下调了Atg7的表达量,作用15 min时差异显著(P0.05),作用30 min时差异极显著(P0.01),IL-6降低了Atg5的表达量,作用60 min时差异显著(P0.05),当IL-6与IFN-γ共同作用4 h时,IL-6同样表现出对Atg7、Atg5表达量的抑制作用。实验结果表明布鲁氏菌16M能促进小鼠巨噬细胞分泌IL-6,且IL-6抑制了IFN-γ诱导的典型自噬。以上研究结果表明布鲁氏菌16M抑制了IFN-γ诱导的MHC II m RNA表达水平;巨噬细胞稳定表达自噬相关蛋白Atg5、Atg7,没有改变布鲁氏菌16M对MHC II m RNA的抑制作用,但解除了布鲁氏菌16M对自噬-溶酶体降解途径的阻滞作用,并且显著提高了细胞表面MHC II类分子的表达量和细胞递呈能力,表明布鲁氏菌通过诱导非典型自噬对感染的细胞产生免疫抑制作用;布鲁氏菌16M能促进小鼠巨噬细胞分泌IL-6,且IL-6抑制IFN-γ诱导的典型自噬,表明布鲁氏菌可能通过IL-6这一途径干扰IFN-γ诱导的典型自噬从而诱发非典型自噬。
【关键词】：布鲁氏菌 自噬 组织相容性复合体 抗原递呈
【学位授予单位】：石河子大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S852.61
【目录】：

• 摘要6-8
• Abstract8-12
• 英文缩略词表12-13
• 引言13-14
• 第一章 文献综述 布鲁氏菌致病和免疫机制及自噬研究概述14-21
• 1.布鲁氏菌致病及免疫的机制14-17
• 1.1 布鲁氏菌的胞内生存方式14-15
• 1.2 布鲁氏菌在胞内的运输15-16
• 1.3 布鲁氏菌的胞内复制16
• 1.4 布鲁氏菌与免疫16-17
• 2.病原体感染与自噬研究进展17-21
• 2.1 细胞自噬的分类17
• 2.2 免疫信号对自噬的调节17-18
• 2.3 细胞自噬清除病原体18
• 2.4 病原体逃避细胞自噬18
• 2.5 病原体利用细胞自噬18
• 2.6 布鲁氏菌感染与自噬研究进展18-19
• 2.7 自噬在抗原递呈中作用的研究进展19-21
• 第二章 实验部分21-55
• 实验一 羊种布鲁氏菌感染小鼠巨噬细胞对MHC II表达和递呈的影响21-46
• 摘要21-22
• 1.材料方法22-35
• 1.1 材料22
• 1.1.1 巨噬细胞和菌株22
• 1.1.2 实验主要试剂22
• 1.1.3 实验主要仪器和设备22
• 1.2 实验方法22-35
• 1.2.1 细胞培养液DMEM和PBS缓冲液配制22
• 1.2.2 小鼠巨噬细胞的培养22-23
• 1.2.3 羊种布鲁氏菌强毒株 16M的培养与鉴定23-24
• 1.2.4 实时荧光定量引物设计24
• 1.2.5 RT-qPCR检测布鲁氏菌侵染巨噬细胞胞内MHC II转录水平24-26
• 1.2.6 构建Atg5和Atg7稳定表达载体26-31
• 1.2.7 重组慢病毒包装31-32
• 1.2.8 慢病毒感染GFP-LC3小鼠巨噬细胞32-33
• 1.2.9 RT-qPCR检测Atg5和Atg7转染效果33
• 1.2.10 RT-qPCR检测稳定表达Atg5和Atg7巨噬细胞MHC II转录水平33
• 1.2.11 激光共聚焦检测自噬小体和溶酶体融合率33-34
• 1.2.12 流式细胞技术检测细胞表面MHC II的表达量34-35
• 1.2.13 流式细胞技术检测细胞表面OMP31的荧光强度35
• 1.2.14 统计学分析35
• 2.实验结果35-44
• 2.1 MHC II分子特异性引物和羊种布鲁氏菌强毒株 16M的鉴定35-36
• 2.2 RT-qPCR检测布鲁氏菌侵染IFN-γ 处理的巨噬细胞MHC II转录水平36-37
• 2.3 PCR扩增Atg5、Atg7基因37-38
• 2.4 双酶切鉴定pMD19-T-Atg5重组载体和pMD19-T-Atg7重组载体38-39
• 2.5 RT-qPCR检测转染效率39-40
• 2.6 RT-qPCR检测布鲁氏菌诱导的自噬对细胞内MHC II转录水平的影响40
• 2.7 布鲁氏菌 16M诱导的自噬对细胞自噬小体和溶酶体融合率影响40-41
• 2.8 布鲁氏菌 16M诱导的自噬对细胞表面MHC II表达水平的研究41-43
• 2.9 布鲁氏菌 16M诱导的自噬对MHC II抗原递呈能力的影响43-44
• 3.讨论44-46
• 实验二 羊种布鲁氏菌感染的巨噬细胞中IL-6 对IFN-γ 诱导的自噬影响46-55
• 摘要46
• 1.实验材料与方法46-49
• 1.1 材料46-47
• 1.1.1 巨噬细胞和菌株46-47
• 1.1.2 实验主要试剂47
• 1.1.3 实验主要仪器和设备47
• 1.2 实验方法47-49
• 1.2.1 ELISA双抗夹心法检测布鲁氏菌感染的巨噬细胞中细胞因子IL-647-48
• 1.2.3 激光共聚焦检测自噬特异性标签GFP-LC3的荧光颗粒48-49
• 1.2.4 RT-qPCR检测自噬相关基因Atg5与Atg7转录水平49
• 1.2.5 统计学分析49
• 2.结果49-53
• 2.1 布鲁氏菌 16M侵染小鼠巨噬细胞细胞因子IL-6 表达量49-50
• 2.2 激光共聚焦检测自噬特异性标签GFP-LC3荧光颗粒数50
• 2.3 RT-qPCR检测IFN-γ 和IL-6 对细胞中自噬相关蛋白的转录水平影响50-53
• 3.讨论53-55
• 全文小结55-56
• 参考文献56-62
• 致谢62-63
• 个人简介63-64
• 导师评阅表64

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前3条

1 张佩君;刘慧;李延华;赵玄多;陈德坤;;抗布鲁菌感染免疫防御机制及相关保护性抗原研究进展[J];动物医学进展;2014年02期

2 李琼;吴淑燕;黄瑞;;自噬在细菌感染与免疫应答中的作用[J];微生物与感染;2009年02期

3 王文玉;樊红琨;赵国强;乔鹏;王书春;伍钢;;Beclin1基因慢病毒表达载体的构建和鉴定[J];中国组织工程研究与临床康复;2011年33期

  本文关键词：羊种布鲁氏菌对巨噬细胞MHC II表达和递呈的影响，由笔耕文化传播整理发布。

本文编号：294543