水稻抗病基因人工进化的初步研究

发布时间：2017-04-11 19:10

  本文关键词：水稻抗病基因人工进化的初步研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：利用抗性基因培育抗性品种是防治水稻病虫害最直接、环保、经济、有效的方法。但目前水稻可利用R基因数量较少,且多数为等位变异基因,过度利用这些抗性基因会引起病原菌快速进化,将导致基因抗性功能的丧失。因此,需要不断挖掘新的抗性基因,丰富抗性基因资源。同时要对抗病基因的结构和功能特点及病原物进化的特点进行研究,进而达到可以通过人为地设计和创造抗性基因来提高品种抗性的目的。对CC-NBS-LRR抗性基因作用模式研究表明,LRR通常参与病原物的识别和NB-LRR蛋白功能的开启与关闭,而CC-NB-ARC结构域则可能会出现自激活的现象。同时,R基因异源表达和PRR基因间嵌合构建的研究表明,结构域在物种间和物种内都有一定的保守性和融合性。基于这种保守性和融合性,我们将白叶枯抗性基因Xa21D和稻瘟病基因Pi36、Pb1、Pita的保守功能域进行划分和相互融合,构建新的抗性基因,同时将Xa21D GC-Rich Region进行变异,构成不完整的Xa21D进行转基因功能验证。希望通过对稻瘟病和白叶枯病的抗性鉴定,可以有效地探寻Xa21D控制功能关键结构或元件,以及四个抗性基因LRR与CC-NB-ARC或Signal Sequence-GC-rich region作用特点,为进一步研究作用机制提供一定研究基础。同时也可以探索这种基因嵌合方式实现广谱和高效地白叶枯病和稻瘟病融合免疫反应的可能。取得以下初步结果：1、根据文献分析和网站预测结果,将Xa21D的结构域划分为Signal Sequence、 GC-rich region和LRR region三部分,Pb1、Pi36和Pita的结构CC-NB-ARC、Link /Spacer和LRR region三部分。将四个基因按照验证结构域功能和创制广谱白叶枯病和稻瘟病的目的,设计了8个结构域来源不同的嵌合抗病基因。2、按照设计要求,成功从四个抗病基因的扩增需要的片段,利用Overlap-PCR将片段按照设计要求进行拼接,获得了8个嵌合体的全长片段,并成功将其构建到植物表达载体PHB中。以水稻粳稻品种TP309作为受体材料,进行水稻的遗传转化。目前获得了RiLP2403、RiLP2406和RiLP2407的转基因To代阳性植株,目前其他嵌合体基因仍在遗传转化中。3、分别对RiLP2403、RiLP2406和RiLP2407三个嵌合体基因的转基因阳性植株进行了初步的稻瘟病抗性鉴定,结果表明三个基因均表现出一定的稻瘟病抗性功能,说明三个嵌合体中有结构域起免疫功能。4、RiLP2403表现出对稻瘟病菌株有明显的抗感差异,说明Pi36 LRR可能参与了稻瘟病效应因子的识别,但尚不能确定其通过间接,还是直接的识别方式。而Xa21D Signal Sequence和GC-Rich未知区域具有可能也是参与免疫反应的重要成分,特别是GC-Rich区域。5、而RiLP2406和RiLP2407鉴定结果不能明确其作用结构域,但可以推测出一些较为可靠的线索。特别是,RiLP2406是由来自于Pi36的CC-NB-ARC区域,Xa21 D的GC-Rich未知区域和LRR区域构成,具有抗白叶枯和稻瘟病两种病害抗性的可能,需要进一步的进行稻瘟病和白叶枯病的鉴定才能明确。本研究利用抗病基因结构域的保守型和融合性特点,将白叶枯病抗性基因Xa21D和稻瘟病抗性基因Pbl,Pi36和Pita各功能域进行划分和融合。获得8个结构域来源不同的嵌合抗病基因,通过转基因验证了部分功能域在抗性反应中的功能,鉴定结果表明,部分嵌合基因表现出稻瘟病抗性功能,并且有实现广谱白叶枯病和稻瘟病融合免疫反应的可能。表明利用抗性基因结构域的保守性和融合性来设计新的抗性基因可能是一种潜在的有效方法。
【关键词】：水稻 稻瘟病 抗病基因嵌合体 转基因
【学位授予单位】：四川农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S511
【目录】：

• 摘要4-6
• Abstract6-11
• 1 文献综述11-27
• 1.1 植物先天免疫系统11-16
• 1.1.1 病原相关分子模式激发的反应(PTI)11-12
• 1.1.2 效应因子引发的免疫反应(ETI)12-14
• 1.1.3 Xa21和Pi-d2介导的抗性14
• 1.1.4 植物系统获得性抗性(SAR)14-16
• 1.2 抗病基因结构与功能16-20
• 1.2.1 R基因结构特点16
• 1.2.2 NB-LRR基因的结构特点16-20
• 1.3 稻瘟病抗性基因的概述20-22
• 1.4 白叶枯病抗性基因的概述22-24
• 1.5 广谱抗性的工程探索24-25
• 1.6 立题依据与研究意义25-27
• 2 试验材料与方法27-33
• 2.1 试验材料27
• 2.1.1 水稻材料与稻瘟病菌株27
• 2.1.2 试验的目的抗性基因27
• 2.1.3 表达载体与菌株27
• 2.1.4 常用基因工程使用的试剂27
• 2.2 试验方法27-33
• 2.2.1 序列分析27-28
• 2.2.2 嵌合片段的构建28-29
• 2.2.3 表达载体连接29-30
• 2.2.4 水稻遗传转化30-32
• 2.2.5 稻瘟病菌的培养与接种鉴定32-33
• 3 试验结果与分析33-44
• 3.1 水稻4个基因的结构分析33
• 3.2 抗病基因嵌合体设计结果33-37
• 3.2.1 Xa21D功能缺失序列的设计33-34
• 3.2.2 XA21D与Pita、Pi36和Pb1 LRR区域的交换34-35
• 3.2.3 CC-NB-ARC的替换35-36
• 3.2.4 NB-LRR蛋白LRR结构域的交换36-37
• 3.3 表达载体的构建37-38
• 3.4 遗传转化植株的获得38-40
• 3.5 稻瘟病的抗性初步研究40-44
• 3.5.1 RiLP240340-42
• 3.5.2 RiLP240642-43
• 3.5.3 RiLP240743-44
• 4 讨论44-46
• 4.1 本研究可行性评价44
• 4.2 本研究的不足44-45
• 4.3 嵌合蛋白的稳定性45-46
• 5 后续研究设想46-47
• 参考文献47-53
• 致谢53

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