茄子单性结实差异表达序列鉴定及SmMsrA基因功能初步分析

发布时间：2017-04-13 10:52

  本文关键词：茄子单性结实差异表达序列鉴定及SmMsrA基因功能初步分析，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：茄子是喜温蔬菜,在保护地反季节栽培和春露地早熟栽培中,常因为低温弱光环境影响而导致授粉受精困难、落花落果增多、产量和效益降低。单性结实茄子在一定程度上能够克服不良环境条件引起的落花落果,提高坐果率、降低栽培成本和改善品质。茄子单性结实对培育早熟、耐低温和高品质的茄子新品种具有重要意义。本研究以茄子单性结实品系D-10和非单性结实品系03-2为试验材料,利用荧光定量PCR技术,鉴定筛选已构建的茄子单性结实SSH-cDNA文库中的差异表达序列。根据克隆获得的茄子甲硫氨酸亚砜还原酶A基因(SmMsrA)的cDNA序列,构建SmMsrA基因的VIGS表达载体和RNAi表达载体,对其功能进行初步分析。主要研究结果如下:1.利用实时荧光定量PCR技术,对构建的茄子单性结实SSH-cDNA文库中的96条Unique ESTs进行相对表达量分析。结果表明,花后4 d和6 d两个时期单性结实品系D-10相对表达量上调的序列数较多。EST序列较高的相对表达量可能对单性结实果实坐果和生长发育具有重要作用。在茄子果实(子房)发育过程中相对表达量有显著差异的EST序列有31条,总体上调表达的EST序列有17条;总体下调表达的EST序列有14条。其中5条序列与抵御低温相关,7条序列与植物激素代谢相关,有多条序列与植物代谢过程中的蛋白质和碳水化合物的合成相关。抵御低温胁迫和植物激素代谢相关的序列可能通过与合成蛋白质和碳水化合物相关的序列相互作用,共同调节单性结实果实的发育。2.利用RT-PCR从茄子单性结实品系D-10中获得甲硫氨酸亚砜还原酶A(SmMsrA)基因的编码区。通过Gateway同源重组技术,构建了3个含SmMsrA基因不同片段的烟草脆裂病毒(Tobacco rattle virus,TRV)介导的基因沉默(VIGS)表达载体pTRV2-SmMsrAi。表达载体转入农杆菌GV3101后,用注射压迫法侵染茄子叶片。采用表型观察、TRV病毒分子检测和qRT-PCR技术,评价构建的VIGS体系对SmMsrA基因的沉默效果。结果表明,报告基因PDS沉默后叶片呈现明显的光漂白现象,SmMsrA基因沉默后叶片呈花叶状、果实变小;叶片和果实中的SmMsrA基因的表达量明显降低;表明Sm MsrA基因是正向调控茄子果实发育的1个相关基因。3.利用Gateway同源重组技术,成功构建了3个含SmMsrA基因不同片段的RNAi表达载体pHellsgate12-Mi。经菌液PCR和测序验证SmMsrA基因的RNAi表达载体构建正确,并转化到农杆菌C58中。为进一步通过转基因技术深入研究SmMsrA基因在茄子果实发育中的功能和调节机制鉴定了基础。
【关键词】：茄子 单性结实 差异表达序列 SmMsrA基因 基因沉默
【学位授予单位】：中国农业科学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S641.1;Q943.2
【目录】：

• 摘要6-7
• Abstract7-14
• 英文缩略表14-15
• 第一章 引言15-22
• 1.1 多胺代谢15-16
• 1.2 多胺与植物结实16-18
• 1.2.1 多胺与开花坐果16-17
• 1.2.2 多胺与果实发育17
• 1.2.3 多胺与单性结实17-18
• 1.3 多胺与植物激素18-20
• 1.3.1 多胺与生长素19
• 1.3.2 多胺与赤霉素19
• 1.3.3 多胺与乙烯19
• 1.3.4 多胺与脱落酸19-20
• 1.4 甲硫氨酸亚砜还原酶与多胺20
• 1.5 存在问题及展望20
• 1.6 研究目的及意义20-21
• 1.7 主要研究内容21
• 1.8 技术路线21-22
• 第二章 茄子差异表达序列的分析22-38
• 2.1 试验材料22
• 2.1.1 植物材料22
• 2.1.2 试剂及溶液22
• 2.2 试验方法22-23
• 2.2.1 试验材料的采集22
• 2.2.2 茄子总RNA的提取22
• 2.2.3 cDNA第一链的合成22-23
• 2.2.4 荧光定量PCR引物的设计23
• 2.2.5 荧光定量PCR分析23
• 2.3 结果与分析23-35
• 2.3.1 荧光定量PCR基因特异引物23-26
• 2.3.2 差异表达序列的qRT-PCR分析26-30
• 2.3.3 茄子果实（子房）发育过程中差异表达序列分析30-35
• 2.4 讨论35-38
• 第三章 茄子SmMsrA基因VIGS表达载体的构建及表达分析38-49
• 3.1 试验材料38-39
• 3.1.1 植物材料和生长条件38
• 3.1.2 试剂及溶液38-39
• 3.1.3 菌株和载体39
• 3.2 试验方法39-42
• 3.2.1 茄子SmMsrA基因的克隆39-40
• 3.2.2 插入片段与TOPO入门克隆载体的连接、转化40
• 3.2.3 LR反应构建VIGS表达载体及农杆菌转化40-41
• 3.2.4 农杆菌侵染41
• 3.2.5 目的基因沉默效率分析41-42
• 3.3 结果与分析42-47
• 3.3.1 茄子SmMsrA基因的克隆42-43
• 3.3.2 SmMsrA基因插入片段的克隆与TOPO入门克隆载体的连接鉴定43
• 3.3.3 VIGS表达载体的构建及农杆菌转化43-44
• 3.3.4 SmMsrA基因的沉默效果表型性状的调查44-47
• 3.4 讨论47-49
• 第四章 茄子SmMsrA基因RANi沉默载体的构建49-57
• 4.1 试验材料49-50
• 4.1.1 植物材料49
• 4.1.2 试剂及溶液49
• 4.1.3 菌株和载体49-50
• 4.2 试验方法50-53
• 4.2.1 RNAi干扰片段的克隆50-51
• 4.2.2 RNAi入门克隆载体的构建和检测51
• 4.2.3 LR反应构建RNAi沉默载体及其鉴定51-52
• 4.2.4 RNAi沉默载体农杆菌的转化52-53
• 4.3 结果与分析53-56
• 4.3.1 SmMsrA基因干扰片段的扩增53
• 4.3.2 SmMsrA基因RNAi入门载体的构建53-55
• 4.3.3 SmMsrA基因RNAi沉默载体的构建及农杆菌转化55-56
• 4.4 讨论56-57
• 第五章 全文总结57-58
• 参考文献58-64
• 附录I64
• 附录II64-65
• 附录III65
• 附录IV65-66
• 附录V66
• 附录VI66-67
• 致谢67-68
• 作者简历68

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前10条

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7 刘s，

本文编号：303413