外源基因neo表达对转基因猪肠道菌群耐药性与非期望效应的影响评估

发布时间：2017-04-14 04:07

  本文关键词：外源基因neo表达对转基因猪肠道菌群耐药性与非期望效应的影响评估，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：neo基因作为标记基因被广泛应用于转基因动、植物研究中,neo基因的表达可能导致的各种副作用及安全隐患也越来越引起大众的关注和担忧。本实验将半同胞的两窝F1代阴性猪和转neo基因猪随机分为两组。A组在1.5月龄时饲喂7天(一个疗程)添加硫酸新霉素的基础日粮,并分别在0D,8D,23D和45D四个阶段取其直肠内容物。B组从断奶后饲喂基础日粮,并在3月龄时屠宰取各肠段肠道内容物。对A、B两组样品进行高通量测序分析。同时,对肠道微生物进行neo基因漂移检测,多重PCR结果表明,外源基因neo没有水平漂移到微生物基因组中。A组数据表明,neo基因的表达产物NPTⅡ蛋白对肠道微生物的耐药性有一定的影响。NPTⅡ蛋白主要来自于死亡和脱落的上皮细胞以及相关的微生物。我们通过对转基因猪和阴性猪饲喂硫酸新霉素前后不同时间点,在门和属水平上的检测发现,低水平的NPTⅡ蛋白能够中和一定量的硫酸新霉素,尽管其具体的机制我们还不清楚。因此,在一定程度上,可以得出以下结论:转基因猪由于neo基因的表达对肠道微生物的耐药性产生了影响。通过对B组阴性猪和转基因猪各相同肠段中菌群分布的比较分析,发现阴性猪与转基因猪在门和属水平上总体差异不大,但还是在某些门和属上,甚至是某些主要门和属上出现了非期望效应。在门和属水平上,通过对A组1.5月龄和B组3月龄阴性猪与转基因猪之间的菌群动态变化比较分析中,发现随着时间的推移,阴性猪与转基因猪主要菌群分布比例出现相反的变化趋势,产生了非期望效应。上诉转基因猪和阴性猪中的细菌在门和属水平上的变化表明,低水平的NPTⅡ蛋白对转基因猪肠道菌群产生非期望效应,其机制有待进一步研究。总之,本文的研究表明,外源基因neo的表达在一定程度上可提高转基因猪的耐药性,可导致转基因猪肠道微生物某些菌群产生非期望效应,同时也可能会对转基因猪的健康产生一定的影响。此研究为我们在转基因研究尤其是转基因产业化开发中慎用neo基因提供了科学的警示,同时此研究通过利用高通量测序技术也为猪的各肠段微生物在时间和空间上的分布及其动态变化积累了宝贵的原始数据。
【关键词】：neo转基因猪 基因水平漂移 微生物耐药性 非期望效应
【学位授予单位】：中国农业科学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S852.6
【目录】：

• 摘要5-6
• Abstract6-10
• 英文缩略表10-11
• 第一章引 言11-16
• 1.1 转基因动物的研究与应用11-12
• 1.1.1 转基因动物的研究11
• 1.1.2 转基因动物的应用11-12
• 1.2 转基因动物生物安全的研究与评价12-13
• 1.2.1 转基因动物安全评价12
• 1.2.2 转基因动环境安全评价12-13
• 1.3 NEO基因的简介与应用13
• 1.4454平台对研究肠道微生物的应用13-14
• 1.5 细菌耐药性14
• 1.6 非期望效应14-15
• 1.7 目的意义和本实验的技术路线15-16
• 1.7.1 研究目的与意义15
• 1.7.2 本实验的技术路线15-16
• 第二章 NEO转基因猪分子鉴定16-21
• 2.1 实验材料16-17
• 2.1.1 实验动物及样品16
• 2.1.2 主要仪器和设备16
• 2.1.3 主要试剂、耗材16
• 2.1.4 所用引物序列16-17
• 2.2 试验方法17-18
• 2.2.1 DNA的提取17
• 2.2.2 PCR检测17
• 2.2.3 Southern Blot检测17-18
• 2.3 实验结果18-20
• 2.3.1 DNA质量检测18
• 2.3.2 酶切检测18-19
• 2.3.3 PCR鉴定结果19
• 2.3.4 Southern Blot鉴定结果19-20
• 2.4 讨论与分析20-21
• 第三章 NEO基因表达产物在肠道组织和肠道内容物中的鉴定21-26
• 3.1 实验材料21-22
• 3.1.1 实验样品21
• 3.1.2 主要仪器和设备21
• 3.1.3 主要试剂、耗材21-22
• 3.2 实验方法22-23
• 3.2.1 Western blot检测22
• 3.2.2 ELISA检测22-23
• 3.3 实验结果23-24
• 3.3.1 Western Blot检测结果23-24
• 3.3.2 Elisa检测结果24
• 3.4 讨论24-26
• 第四章 NEO转基因猪外源基因水平漂移评估26-30
• 4.1 实验材料26
• 4.1.1 实验主要试剂26
• 4.2 实验方法26-27
• 4.2.1 粪便DNA的提取26-27
• 4.2.2 多重PCR技术27
• 4.3 实验结果27-28
• 4.4 讨论分析28-30
• 第五章外源基因NEO表达对猪肠道微生物耐药性的影响30-41
• 5.1 实验材料30
• 5.1.1 样品采集30
• 5.1.2 主要实验仪器和试剂30
• 5.2 实验步骤30-32
• 5.2.1.剪切、连接30
• 5.2.2.单链DNA模板的分离30-31
• 5.2.3.emPCR31
• 5.2.4.测序反应31
• 5.2.5. 生物信息分析流程31-32
• 5.3 实验结果32-39
• 5.3.1 实验数据处理32-35
• 5.3.2 A组转基因猪和阴性猪微生物在门水平上不同程度和规模的改变35-36
• 5.3.3 A组转基因猪和阴性猪微生物在属水平上不同程度和规模的改变36-39
• 5.4 分析与讨论39-41
• 第六章外源基因NEO表达对猪肠道微生物产生的非期望效应41-54
• 6.1 实验材料41
• 6.1.1 样品采集41
• 6.1.2 主要实验仪器和试剂41
• 6.2 实验步骤41
• 6.3 实验结果41-53
• 6.3.1 实验数据处理41-44
• 6.3.2 B组转基因猪和阴性猪不同肠段细菌在门水平上的变化44-46
• 6.3.3 B组转基因猪和阴性猪不同肠段细菌在属水平上的变化46-50
• 6.3.4 1.5月龄到3月龄时，，A组和B组转基因猪和阴性猪肠道细菌在门水平上的动态变化50-51
• 6.3.5 1.5月龄到3月龄时，A组和B组转基因猪和阴性猪肠道细菌在属水平上的动态变化51-53
• 6.4 分析与讨论53-54
• 第七章全文结论54-55
• 参考文献55-61
• 致谢61-62
• 作者简历62

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前3条

1 李明,魏辅文,饶刚,方盛国,冯祚建;非损伤性取样法在保护遗传学研究中的应用[J];动物学报;2001年03期

2 崔泽林;郭晓奎;;食物链中抗生素耐药性基因的转移[J];中国微生态学杂志;2011年01期

3 顾兵;童明庆;刘根焰;倪芳;赵旺胜;梅亚宁;文怡;魏源华;黄s顂

本文编号：305162