大叶蛇葡萄黄酮类成分生物合成关键基因的克隆及功能鉴定
发布时间：2021-03-03 19:02
大叶蛇葡萄（Ampelopsis megalophylla Diels et Gilg）又称大叶山葡萄,是我国湖北省恩施地区一种具特色的药用植物,其嫩叶及嫩茎的加工品在当地被称为“霉茶”。目前大叶蛇葡萄的药用资源主要来源于野生,不同来源的大叶蛇葡萄品质存在着一定的差异。众所周知,药用植物资源品质的优劣与其积累的活性次生代谢产物有着直接关系。因此,为了从源头控制其资源品质,需从分子生物学角度阐明活性成分的生物合成途径。目前有关大叶蛇葡萄主要活性成分生物合成关键酶基因的克隆及功能鉴定研究未见报道。本论文基于课题组前期建立的大叶蛇葡萄的转录组数据库,筛选了大叶蛇葡萄活性成分黄酮类化合物生物合成的关键基因,拟克隆编码大叶蛇葡萄类黄酮-3’,5’-羟化酶（F3’,5’H）、无色花色素还原酶（LAR）、黄酮醇-3-羟化酶（F3H）的基因以及进行关键基因F3’,5’H的功能鉴定,以期为大叶蛇葡萄活性成分生物合成分子机制的阐明,以及将来进一步从基因组水平改良大叶蛇葡萄药用植物资源品质提供依据。具体研究内容及结果如下:（1）本论文在前期研究基础上,以大叶蛇葡萄嫩叶为实验材料,通过RT-PCR技术克隆了F...
【文章来源】：湖北中医药大学湖北省
【文章页数】：131 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
大叶蛇葡萄叶片RNA凝胶电泳图
湖北中医药大学2020届硕士学位论文20图1-2F3’,5’H基因全长克隆凝胶电泳图Fig.1-2Full-lengthcloningofF3’,5’Hbygelelectrophoresis注：Marker为TransDNAMarker，F3’,5’H为F3’,5’H基因3.2.2大叶蛇葡萄F3’,5’H基因序列分析F3’,5’H基因序列经BLAST搜索比对后发现与藤茶（Ampelopsisgrossedentata）的F3’,5’H相似性最高为99%；与葡萄（Vitisvinifera）的F3’,5’H相似性为93%~94%。将测序结果通过DNAMAN等软件进行基本的信息分析，得到大叶蛇葡萄F3’,5’H基因全长1931bp，其中包含一个长度为1527bp的开放阅读框，编码508个氨基酸残基（图1-3）。3.3大叶蛇葡萄F3’,5’H基因编码蛋白生物信息学分析3.3.1F3’,5’H基因编码蛋白质的理化性质分析利用ServerExPASy-ProtParamtool的在线软件分析F3’,5’H基因编码氨基酸的理化性质，发现其相对分子质量为56.84KDa，等电点为8.50，分子式为C2549H4038N694O717S30，不稳定指数为39.23，属于稳定蛋白，脂肪族指数为92.17，总平均疏水性为-0.059小于0，为亲水性蛋白。该蛋白含有508个氨基酸，其中亮氨酸（Leu）含量最高为11.4%，其次是丙氨酸（Ala）为8.5%，半胱氨酸（Cys）最低为0.8%。其中有53个负电荷氨基酸残基（Asp+Glu），56个正电荷氨基酸残基
大叶蛇葡萄黄酮类成分生物合成关键基因的克隆及功能鉴定（Arg+Lys），表明大叶蛇葡萄 F3’,5’H 蛋白是亲水性蛋白。利用 NCBIConcserved Domain 搜 索 后 发 现 F3’,5’H 基 因 编 码 的 蛋 白 属 于 P450（Cytochrome P450）家族成员（图 1-4）。
【参考文献】：
期刊论文
[1]明月草总黄酮对2型糖尿病模型小鼠降血糖作用研究[J]. 林腾,尹伟,许燕,王章姐,陶阿丽. 滨州医学院学报. 2018(05)
[2]沙棘果渣总黄酮的降血脂及降血糖作用[J]. 孙琛,冯野,谢培,宋忠兴,唐志书. 世界中医药. 2018(01)
[3]竹柳叶中黄酮类化合物的提取工艺和成分分析研究[J]. 韩颖,吕晓玲. 食品研究与开发. 2017(14)
[4]大叶蛇葡萄提取物对SMMC-7721细胞增殖抑制作用的研究[J]. 黄静,桂春,答国政,尚祥伟,明小芳,张秀桥. 中国现代中药. 2017(04)
[5]胡柚皮黄酮对高脂血症大鼠的降血脂作用研究[J]. 杨佩磊,蒋剑平,李全清,伍旭明,陈芝芸. 中国中药杂志. 2017(05)
[6]黄酮类化合物的构效关系研究进展[J]. 赵雪巍,刘培玉,刘丹,孙珊珊,李贞,余可馨,张嫚丽,史清文. 中草药. 2015(21)
[7]彩色马铃薯品种‘转心乌’类黄酮-3’5’-羟化酶（F3’5’H）基因的生物信息学和表达分析[J]. 肖继坪,杨晓娜,郭华春. 基因组学与应用生物学. 2015(07)
[8]筛选大叶蛇葡萄体外抗肿瘤活性物质[J]. 桂春,黄静,程佩佩,方玉,夏叶,张秀桥. 中成药. 2015(07)
[9]葛根素心血管保护作用及其机制研究进展[J]. 魏述永. 中国中药杂志. 2015(12)
[10]药用植物转录因子AP2/ERF研究与展望[J]. 季爱加,罗红梅,徐志超,张鑫,宋经元,陈士林. 科学通报. 2015(14)
硕士论文
[1]黑穗醋栗类黄酮-3’,5’-羟化酶基因的克隆及表达特性研究[D]. 汤雪.东北农业大学 2018
[2]大叶蛇葡萄不同器官黄酮类化合物代谢路径差异表达基因研究[D]. 答国政.湖北中医药大学 2017
[3]茶树儿茶素在芽中积累规律及茶树F3’5’H2的功能分析[D]. 王新珍.安徽农业大学 2016
[4]茶树类黄酮-3’,5’-羟基化酶的功能分析[D]. 许玉娇.安徽农业大学 2014
[5]大叶蛇葡萄黄酮提取物血清药化及其对心、肾的保护作用研究[D]. 江灿.湖北中医药大学 2013
[6]三种云南野生观赏植物中类黄酮3’，5’羟基化酶基因的克隆及其表达分析[D]. 王翠丽.华中农业大学 2012
[7]茶树类黄酮3’，5’-羟基化酶的基因克隆与功能研究[D]. 陈啸天.安徽农业大学 2012
[8]大叶蛇葡萄总黄酮提取物质量分析及其降压药效学研究[D]. 杨若婧.湖北中医药大学 2012
[9]新疆紫茉莉黄酮类化合物及色素的初步研究[D]. 李凌智.新疆大学 2010
[10]根癌农杆菌介导的F3’5’H基因对菊花遗传转化的初步研究[D]. 徐建.西南大学 2007
本文编号：3061772
【文章来源】：湖北中医药大学湖北省
【文章页数】：131 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
大叶蛇葡萄叶片RNA凝胶电泳图
湖北中医药大学2020届硕士学位论文20图1-2F3’,5’H基因全长克隆凝胶电泳图Fig.1-2Full-lengthcloningofF3’,5’Hbygelelectrophoresis注：Marker为TransDNAMarker，F3’,5’H为F3’,5’H基因3.2.2大叶蛇葡萄F3’,5’H基因序列分析F3’,5’H基因序列经BLAST搜索比对后发现与藤茶（Ampelopsisgrossedentata）的F3’,5’H相似性最高为99%；与葡萄（Vitisvinifera）的F3’,5’H相似性为93%~94%。将测序结果通过DNAMAN等软件进行基本的信息分析，得到大叶蛇葡萄F3’,5’H基因全长1931bp，其中包含一个长度为1527bp的开放阅读框，编码508个氨基酸残基（图1-3）。3.3大叶蛇葡萄F3’,5’H基因编码蛋白生物信息学分析3.3.1F3’,5’H基因编码蛋白质的理化性质分析利用ServerExPASy-ProtParamtool的在线软件分析F3’,5’H基因编码氨基酸的理化性质，发现其相对分子质量为56.84KDa，等电点为8.50，分子式为C2549H4038N694O717S30，不稳定指数为39.23，属于稳定蛋白，脂肪族指数为92.17，总平均疏水性为-0.059小于0，为亲水性蛋白。该蛋白含有508个氨基酸，其中亮氨酸（Leu）含量最高为11.4%，其次是丙氨酸（Ala）为8.5%，半胱氨酸（Cys）最低为0.8%。其中有53个负电荷氨基酸残基（Asp+Glu），56个正电荷氨基酸残基
大叶蛇葡萄黄酮类成分生物合成关键基因的克隆及功能鉴定（Arg+Lys），表明大叶蛇葡萄 F3’,5’H 蛋白是亲水性蛋白。利用 NCBIConcserved Domain 搜 索 后 发 现 F3’,5’H 基 因 编 码 的 蛋 白 属 于 P450（Cytochrome P450）家族成员（图 1-4）。
【参考文献】：
期刊论文
[1]明月草总黄酮对2型糖尿病模型小鼠降血糖作用研究[J]. 林腾,尹伟,许燕,王章姐,陶阿丽. 滨州医学院学报. 2018(05)
[2]沙棘果渣总黄酮的降血脂及降血糖作用[J]. 孙琛,冯野,谢培,宋忠兴,唐志书. 世界中医药. 2018(01)
[3]竹柳叶中黄酮类化合物的提取工艺和成分分析研究[J]. 韩颖,吕晓玲. 食品研究与开发. 2017(14)
[4]大叶蛇葡萄提取物对SMMC-7721细胞增殖抑制作用的研究[J]. 黄静,桂春,答国政,尚祥伟,明小芳,张秀桥. 中国现代中药. 2017(04)
[5]胡柚皮黄酮对高脂血症大鼠的降血脂作用研究[J]. 杨佩磊,蒋剑平,李全清,伍旭明,陈芝芸. 中国中药杂志. 2017(05)
[6]黄酮类化合物的构效关系研究进展[J]. 赵雪巍,刘培玉,刘丹,孙珊珊,李贞,余可馨,张嫚丽,史清文. 中草药. 2015(21)
[7]彩色马铃薯品种‘转心乌’类黄酮-3’5’-羟化酶（F3’5’H）基因的生物信息学和表达分析[J]. 肖继坪,杨晓娜,郭华春. 基因组学与应用生物学. 2015(07)
[8]筛选大叶蛇葡萄体外抗肿瘤活性物质[J]. 桂春,黄静,程佩佩,方玉,夏叶,张秀桥. 中成药. 2015(07)
[9]葛根素心血管保护作用及其机制研究进展[J]. 魏述永. 中国中药杂志. 2015(12)
[10]药用植物转录因子AP2/ERF研究与展望[J]. 季爱加,罗红梅,徐志超,张鑫,宋经元,陈士林. 科学通报. 2015(14)
硕士论文
[1]黑穗醋栗类黄酮-3’,5’-羟化酶基因的克隆及表达特性研究[D]. 汤雪.东北农业大学 2018
[2]大叶蛇葡萄不同器官黄酮类化合物代谢路径差异表达基因研究[D]. 答国政.湖北中医药大学 2017
[3]茶树儿茶素在芽中积累规律及茶树F3’5’H2的功能分析[D]. 王新珍.安徽农业大学 2016
[4]茶树类黄酮-3’,5’-羟基化酶的功能分析[D]. 许玉娇.安徽农业大学 2014
[5]大叶蛇葡萄黄酮提取物血清药化及其对心、肾的保护作用研究[D]. 江灿.湖北中医药大学 2013
[6]三种云南野生观赏植物中类黄酮3’，5’羟基化酶基因的克隆及其表达分析[D]. 王翠丽.华中农业大学 2012
[7]茶树类黄酮3’，5’-羟基化酶的基因克隆与功能研究[D]. 陈啸天.安徽农业大学 2012
[8]大叶蛇葡萄总黄酮提取物质量分析及其降压药效学研究[D]. 杨若婧.湖北中医药大学 2012
[9]新疆紫茉莉黄酮类化合物及色素的初步研究[D]. 李凌智.新疆大学 2010
[10]根癌农杆菌介导的F3’5’H基因对菊花遗传转化的初步研究[D]. 徐建.西南大学 2007
本文编号：3061772
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