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梭梭SUMO E3连接酶基因HaSIZ1的克隆和功能分析

发布时间:2021-03-03 17:41
  干旱、土壤盐渍化和极端温度是影响植物生长、限制农作物生产的重要非生物胁迫。SUMO(Small ubiquitin-like modifier)化作为一种重要的翻译后修饰,在调控植物生长、发育和逆境应答等方面发挥着重要作用。E3连接酶SIZ1可直接介导SUMO蛋白与靶蛋白的结合,直接影响植物在多种非生物胁迫下的SUMO化响应。目前对SIZ1介导的SUMO化的研究都集中在拟南芥和水稻等甜土植物,荒漠植物大都具有极强的抗复合逆境能力,它们的SUMO E3连接酶是否具有与甜土植物不一样的调控,目前还不清楚。本研究以我国西北荒漠地区优势物种梭梭为材料,分析了SUMO化在其应对渗透胁迫、高盐、高温和低温过程中的响应;并以其SUMO E3连接酶的编码基因HaSIZ1为重点,克隆了HaSIZ1的cDNA全长并进行了胁迫处理下的表达模式分析、亚细胞定位和拟南芥转化等,取得以下主要研究结果:(1)克隆到梭梭HaSUMO1基因,其cDNA全长为632 bp,ORF为291bp,共编码96个氨基酸;HaSUMO1分子量约10.9 kDa,与拟南芥AtSUMO1氨基酸同源性约86%,Anti-AtSUMO1抗... 

【文章来源】:兰州大学甘肃省 211工程院校 985工程院校 教育部直属院校

【文章页数】:74 页

【学位级别】:硕士

【部分图文】:

梭梭SUMO E3连接酶基因HaSIZ1的克隆和功能分析


SUMO化/去SUMO化循环过程(改自Elrouby等,2015)

梭梭,琼脂糖,凝胶电泳


兰州大学硕士学位论文梭梭SUMOE3连接酶基因HaSIZ1的克隆和功能分析31第三章结果与分析3.1不同胁迫处理诱导梭梭SUMO化蛋白的积累3.1.1梭梭HaSUMO1基因的克隆在拟南芥、水稻、苹果和番茄等植物中的研究表明,在不同胁迫处理下,植物体内SUMO化蛋白会发生不同程度的积累(张耸等,2017)。SUMO1是高等植物响应非生物胁迫的重要SUMO蛋白,其在真核生物中高度保守,前人在水稻(Chaikam等,2010)、烟草(Zhang等,2017)和苹果(Zhou等,2017)上的研究均利用拟南芥Anti-AtSUMO1抗体进行免疫反应。为了得到梭梭HaSUMO1的氨基酸序列,以比较其与拟南芥AtSUMO1的同源性,首先在NCBI网站下载了与梭梭同属藜科的甜菜(Betavulgaris)、菠菜(Spinaciaoleracea)和藜麦(Chenopodiumquinoa)的SUMO1基因序列,分别为BvSUMO1(XM_010677451.2)、SoSUMO1(XM_021993360.1)和CqSUMO1(XM_021899999.1)。利用DNAMAN软件比对其核苷酸序列,并在5’和3’非编码区保守区域设计引物,以梭梭cDNA为模板,扩增到了梭梭HaSUMO1基因cDNA序列(如图3-1),回收此条带,连接到克隆载体pMD19-T并转化大肠杆菌,挑取阳性克隆测序,将所得序列用NCBI网站BLAST工具进行比对,确定所得序列为梭梭HaSUMO1基因序列。图3-1梭梭HaSUMO1cDNA扩增产物的琼脂糖凝胶电泳图Figure3-1AgarosegelelectrophoresisofHaSUMO1cDNAproducts克隆到梭梭HaSUMO1基因cDNA序列共632bp,5’非编码区85bp,3’非编码区256bp,ORF全长291bp,共编码96个氨基酸(如图3-2),预测HaSUMO1蛋白分子量约10.9kDa,等电点为4.93(https://web.expasy.org/compute_pi/)。

氨基酸序列,氨基酸序列,核苷酸序列,梭梭


兰州大学硕士学位论文梭梭SUMOE3连接酶基因HaSIZ1的克隆和功能分析32图3-2HaSUMO1基因核苷酸序列及编码氨基酸序列预测Figure3-2NucleotidesequenceandpredictedcoaddingaminoacidsequenceofHaSUMO13.1.2Anti-AtSUMO1抗体可用于检测梭梭中SUMO蛋白利用DNAMAN软件比对梭梭HaSUMO1和拟南芥AtSUMO1的氨基酸序列,发现二者具有很高的同源性(约86%)(图3-3A),因此,推测Anti-AtSUMO1抗体可能也能用于对梭梭体内SUMO化蛋白的检测。分别提取拟南芥和梭梭幼苗总蛋白,用Anti-AtSUMO1抗体进行Westernblot检测。发现梭梭和拟南芥样品在约11kDa处均可检测到游离SUMO蛋白,说明Anti-AtSUMO1抗体可用于检测梭梭中的SUMO化蛋白(图3-3B)。图3-3AtSUMO1抗体检测拟南芥和梭梭SUMO1蛋白A:梭梭HaSUMO1和拟南芥AtSUMO1氨基酸序列比对,B:拟南芥Anti-AtSUMO1抗体检测梭梭和拟南芥游离态SUMO蛋白Figure3-3DetectSUMO1ofArabidopsisandH.ammodendronuseAnti-body,A:AminoacidalignmentofAtSUMO1andHaSUMO1,B:DetectfreeSUMOofArabidopsisandH.ammodendronuseAtSUMO1anti-body

【参考文献】:
期刊论文
[1]SUMO E3连接酶在植物适应非生物胁迫中的作用研究进展[J]. 汪永平,任伟,王润娟,邵坤仲,高慧娟,张金林.  生物技术通报. 2020(02)
[2]SUMO E3连接酶在植物生长发育中的功能研究进展[J]. 韩丹璐,赖建彬,阳成伟.  植物学报. 2018(02)
[3]高等植物适应盐逆境研究进展[J]. 张金林,李惠茹,郭姝媛,王锁民,施华中,韩庆庆,包爱科,马清.  草业学报. 2015(12)
[4]植物SIZ1 SUMO E3连接酶的研究进展[J]. 张耸,李晓东,孟庆伟.  植物生理学报. 2014(04)
[5]植物响应干旱胁迫的分子机制[J]. 康宗利,杨玉红,张立军.  玉米科学. 2006(02)

博士论文
[1]苹果SUMO E3连接酶MdSIZ1调控逆境应答和花青苷积累的研究[D]. 张蕊芬.山东农业大学 2016



本文编号:3061662

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