布鲁氏菌中CRISPRi与CRISPR/Cas9系统的构建及功能验证
发布时间：2021-04-15 15:13
布鲁氏菌病（brucellosis）是一种波及世界的重要的人畜共患病,对畜牧业造成了严重的经济损失,因为它人畜共患病的特点,也使其成为了人类健康和社会安全的一大威胁。然而,迄今为止,都未能研发出安全有效的疫苗。布鲁氏菌（Brucella）,又称作布氏杆菌,是造成布鲁氏菌病的病原体,要研发出安全有效的疫苗,对该菌各类基因的功能研究是十分重要的。目前,对布鲁氏菌基因的功能研究存在许多困难。一是布鲁氏菌生长缓慢,在实验室稳定的培养环境下,菌体需要生长36-48h才能在平板上长出肉眼可见的菌落。初次分离的野生菌株生长往往更加缓慢。二是布鲁氏菌病人畜共患的特征,使得对布鲁氏菌的操作变的相当繁琐和耗时。这些因素都使得对布鲁氏菌基因的研究变得格外困难。目前,对布鲁氏菌基因功能的研究主要是依靠自杀质粒,通过单交换和双交换建立基因缺失株,再通过对基因缺失株的研究探索基因功能。但是,该方法耗时长,操作量大,大大增加了科研人员的操作风险,同时也减缓了研究进度。所以,在布鲁氏菌中创建一类迅速、精准、有效的基因研究方式是具备重要意义的。CRISPRi与CRISPR/Cas9系统,是近年发展迅速的领先的基因研究方...
【文章来源】：华中农业大学湖北省 211工程院校 教育部直属院校
【文章页数】：97 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
布鲁氏菌侵染巨噬细胞模型
华中农业大学 2017 届硕士研究生学位论文长度一般在300到500bp之间。前导序列因为包含转录的起始位点，一般会作为CRISPR序列的启动子发挥作用。重复序列的长度一般在23bp到55bp之间，其序列的两端存在对称结构，这意味着，该序列转录出的RNA可能会具有类似发夹的结构。该构造能够确保它顺利与有关的Cas蛋白结合，形成核蛋白复合体，发挥生物学功能(Kuzminov 2001; Hsu et al 2013)。间隔序列的长度一般在21bp到72bp之间，值得一提的是，间隔序列原本并非细菌自身基因组的一部分，而是来自于侵染细菌的噬菌体、质粒等外源DNA。这些被整合到基因组中的间隔序列，能够让细菌识别并免疫相同外源DNA的再次入侵(李辉和施振旦 2013)。Cas基因位于CRISPR基因的附近，Half和Makarova等科学家通过生物信息学等方式，对Cas基因做出了深入的研究，并且发现，Cas蛋白具有多种生物学功能，其结构中含有核酸酶、解旋酶、聚合酶和与转录调控等相关的多种结构域(Makarova et al2006)。
布鲁氏菌中 CRISPRi 与 CRISPR/Cas9 系统的构建及功能验证CASCAD复合物中，crRNA具有识别外源DNA片段的能力，使整个复合物附着在外源DNA上，随后由Cas3蛋白进行切割。因此，可以说Cas3蛋白是Type I类CRISPR/Cas系统干扰阶段中最重要的蛋白。TypeII类别CRISPR/Cas系统的构造在3种CRISPR/Cas系统中是最单一的。该系统具有4种Cas蛋白，分别为Cas1、Cas2、Cas9、Csn2或Cas4（TypeII-A或TypeII-B亚型）。在这之中，Cas9蛋白是TypeII类别CRISPR/Cas系统特有的蛋白。Cas9蛋白分子量很大，具有多种功能，不仅能参与pre-crRNA的成熟加工，也能起到核酸酶的功能，对外源DNA进行切割(Garneau et al 2010)。TypeIII类别的CRISPR/Cas系统独有蛋白为Cas10蛋白，该蛋白同样具有加工pre-crRNA和沉默外源DNA的功能。TypeIII型CRISPR/Cas系统又分为TypeIII-A和TypeIII-B两种亚型，有研究证明，这两种亚型的CRISPR/Cas系统的主要区别在于作用的靶标，其中，TypeIII-A型作用于mRNA，而TypeIII-B型作用于DNA(Marraffini and Sontheimer 2008; Hale et al 2009)。
【参考文献】：
期刊论文
[1]布鲁氏菌病研究进展[J]. 马茜,薛兰. 疾病监测与控制. 2014(09)
[2]布鲁氏菌病防治基础研究现状与展望[J]. 高彦辉,赵丽军,孙殿军,顾爱华,张作文,董尔丹. 中国科学:生命科学. 2014(06)
[3]布鲁氏菌病病原学研究进展[J]. 孙涛,赵宝,冉红志,朱永周,许敏. 家畜生态学报. 2014(01)
[4]CRISPR/Cas系统:RNA靶向的基因组定向编辑新技术[J]. 李君,张毅,陈坤玲,单奇伟,王延鹏,梁振,高彩霞. 遗传. 2013(11)
[5]CRISPR/Cas9新型基因打靶系统的研究进展[J]. 李辉,施振旦. 江苏农业学报. 2013(04)
[6]国内外牛布鲁氏菌病防治研究进展[J]. 王国栋,刘书梅. 安徽农学通报. 2013(16)
[7]CRISPR/Cas9介导的基因组定点编辑技术[J]. 方锐,畅飞,孙照霖,李宁,孟庆勇. 生物化学与生物物理进展. 2013(08)
[8]动物布鲁氏菌病疫苗应用现状及研究进展[J]. 丁家波,冯忠武. 生命科学. 2013(01)
[9]我国布鲁氏菌感染的研究现状及展望[J]. 成岩,白靓,张树军. 内蒙古民族大学学报(自然科学版). 2012(03)
[10]布鲁氏菌病流行趋势及其防治措施的研究进展[J]. 陈丹,柳晓琳,刘孝刚,程晓萍. 中国地方病防治杂志. 2011(01)
本文编号：3139574
【文章来源】：华中农业大学湖北省 211工程院校 教育部直属院校
【文章页数】：97 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
布鲁氏菌侵染巨噬细胞模型
华中农业大学 2017 届硕士研究生学位论文长度一般在300到500bp之间。前导序列因为包含转录的起始位点，一般会作为CRISPR序列的启动子发挥作用。重复序列的长度一般在23bp到55bp之间，其序列的两端存在对称结构，这意味着，该序列转录出的RNA可能会具有类似发夹的结构。该构造能够确保它顺利与有关的Cas蛋白结合，形成核蛋白复合体，发挥生物学功能(Kuzminov 2001; Hsu et al 2013)。间隔序列的长度一般在21bp到72bp之间，值得一提的是，间隔序列原本并非细菌自身基因组的一部分，而是来自于侵染细菌的噬菌体、质粒等外源DNA。这些被整合到基因组中的间隔序列，能够让细菌识别并免疫相同外源DNA的再次入侵(李辉和施振旦 2013)。Cas基因位于CRISPR基因的附近，Half和Makarova等科学家通过生物信息学等方式，对Cas基因做出了深入的研究，并且发现，Cas蛋白具有多种生物学功能，其结构中含有核酸酶、解旋酶、聚合酶和与转录调控等相关的多种结构域(Makarova et al2006)。
布鲁氏菌中 CRISPRi 与 CRISPR/Cas9 系统的构建及功能验证CASCAD复合物中，crRNA具有识别外源DNA片段的能力，使整个复合物附着在外源DNA上，随后由Cas3蛋白进行切割。因此，可以说Cas3蛋白是Type I类CRISPR/Cas系统干扰阶段中最重要的蛋白。TypeII类别CRISPR/Cas系统的构造在3种CRISPR/Cas系统中是最单一的。该系统具有4种Cas蛋白，分别为Cas1、Cas2、Cas9、Csn2或Cas4（TypeII-A或TypeII-B亚型）。在这之中，Cas9蛋白是TypeII类别CRISPR/Cas系统特有的蛋白。Cas9蛋白分子量很大，具有多种功能，不仅能参与pre-crRNA的成熟加工，也能起到核酸酶的功能，对外源DNA进行切割(Garneau et al 2010)。TypeIII类别的CRISPR/Cas系统独有蛋白为Cas10蛋白，该蛋白同样具有加工pre-crRNA和沉默外源DNA的功能。TypeIII型CRISPR/Cas系统又分为TypeIII-A和TypeIII-B两种亚型，有研究证明，这两种亚型的CRISPR/Cas系统的主要区别在于作用的靶标，其中，TypeIII-A型作用于mRNA，而TypeIII-B型作用于DNA(Marraffini and Sontheimer 2008; Hale et al 2009)。
【参考文献】：
期刊论文
[1]布鲁氏菌病研究进展[J]. 马茜,薛兰. 疾病监测与控制. 2014(09)
[2]布鲁氏菌病防治基础研究现状与展望[J]. 高彦辉,赵丽军,孙殿军,顾爱华,张作文,董尔丹. 中国科学:生命科学. 2014(06)
[3]布鲁氏菌病病原学研究进展[J]. 孙涛,赵宝,冉红志,朱永周,许敏. 家畜生态学报. 2014(01)
[4]CRISPR/Cas系统:RNA靶向的基因组定向编辑新技术[J]. 李君,张毅,陈坤玲,单奇伟,王延鹏,梁振,高彩霞. 遗传. 2013(11)
[5]CRISPR/Cas9新型基因打靶系统的研究进展[J]. 李辉,施振旦. 江苏农业学报. 2013(04)
[6]国内外牛布鲁氏菌病防治研究进展[J]. 王国栋,刘书梅. 安徽农学通报. 2013(16)
[7]CRISPR/Cas9介导的基因组定点编辑技术[J]. 方锐,畅飞,孙照霖,李宁,孟庆勇. 生物化学与生物物理进展. 2013(08)
[8]动物布鲁氏菌病疫苗应用现状及研究进展[J]. 丁家波,冯忠武. 生命科学. 2013(01)
[9]我国布鲁氏菌感染的研究现状及展望[J]. 成岩,白靓,张树军. 内蒙古民族大学学报(自然科学版). 2012(03)
[10]布鲁氏菌病流行趋势及其防治措施的研究进展[J]. 陈丹,柳晓琳,刘孝刚,程晓萍. 中国地方病防治杂志. 2011(01)
本文编号：3139574
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