ZmFBL41互作蛋白ZmFAH在玉米纹枯病抗性中的功能验证
发布时间：2021-08-13 02:23
本研究前期通过对318份玉米自交系的全基因组关联分析克隆到一个纹枯病抗性基因ZmFBL41。在玉米自交系B73中,ZmFBL41编码F-box蛋白,负调控玉米对纹枯病的抗性。ZmFBL41蛋白是E3泛素连接酶复合体（Skpl-Cullins-F-box,SCF）的重要组成部分,在感病型玉米B73中介导SCF复合体对肉桂醇脱氢酶ZmCAD的降解,使得木质素合成受阻,积累量下降。而在抗病玉米自交系如Chang7-2中,ZmFBL41Chang7-2存在两个关键氨基酸的替换,使其丧失了与底物ZmCAD的特异性结合,从而无法介导ZmCAD的降解,积累木质素而抗病。同时,将ZmFBL41B73的LRR作为诱饵蛋白进行SCFZmFBL41底物蛋白的筛选过程中,除了上述鉴定的ZmCAD之外,还筛选到其他候选互作蛋白,如富马酰基乙酰乙酸水解酶（ZmFAH）。为更全面解析ZmFBL41介导的纹枯病抗性机制,本研究对其蛋白互作进行了验证,对ZmFAH在抗纹枯病过程中的降解和生物学功能开展了相关研究,取得以下主要研究结果。1.利用酵母双杂交技...
【文章来源】：山东农业大学山东省
【文章页数】：55 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
候选基因CDS区扩增Fig.1CDSamplificationofcandidategenes
ZmFBL41互作蛋白ZmFAH在玉米纹枯病抗性中的功能验证26ZmFBL41B73LRR诱饵载体同时导入Y2HGold菌株中，以pGADT7载体与pGBKT7::ZmFBL41B73LRR同时转化Y2HGold菌株作为阴性对照。所有转化酵母涂布到SD/-Trp-Leu培养基上筛选培养，将阳性酵母菌株扩大培养，依次按照浓度梯度对应加到SD/-Trp-Leu和SD/-Ade-His-Trp-Leu培养基上继续培养。结果（图2）显示：在SD/-Trp-Leu培养基上所有酵母菌株都能够正常生长，而在SD/-Ade-His-Trp-Leu培养基上只有同时转有pGBKT7::ZmFBL41B73LRR和pGADT7::ZmFAH载体的酵母菌株正常生长，而转有其他三个蛋白的酵母菌株不能生长，说明ZmFAH蛋白能够与ZmFBL41的LRR结构域互作，因此将ZmFAH蛋白作为候选蛋白进行深入研究。图2酵母双杂交验证ZmFBL41蛋白LRR结构域与候选蛋白的互作Fig.2ValidationoftheinteractionbetweentheLRRdomainofZmFBL41andeachcandidateproteinsusingyeasttwo-hybridization3.3免疫共沉淀实验验证ZmFBL41蛋白LRR结构域与ZmFAH蛋白互作首先将ZmFBL41B73LRR构建到pCXUN-Myc载体中，将ZmFAH构建到pCXUN-HA载体中，分别导入到农杆菌GV3101，利用载体引物Ubi-F和片段自身引物通过PCR对农杆菌进行进一步确认（图3A左ZmFAH1365bp，右1465bp图3B左ZmFBL41B73LRR323bp，右423bp）。利用农杆菌介导的烟草瞬时表达技术在本生烟叶片中表达ZmFBL41蛋白的LRR结构域和ZmFAH蛋白，提取总蛋白后进行免疫共沉淀并通过western
山东农业大学硕士学位论文27blotting进行检测。结果表明（图3C），在Input样品中，对照组和实验组均能够检测到相应的蛋白条带，说明蛋白均被正常表达；经HA磁珠的IP操作后，实验组检测到ZmFAH-HA蛋白，也检测到了ZmFBL41B73LRR-Myc蛋白；而对照组仅检测到ZmFBL41B73LRR蛋白，没有检测到ZmFAH-HA蛋白，该结果证明了ZmFBL41蛋白的LRR结构域在体内也能够与ZmFAH互作。图3免疫共沉淀实验验证ZmFBL41B73LRR与ZmFAH的互作Fig.3TheinteractionbetweenZmFBL41B73LRRandZmFAHwasverifiedbyco-immunocoprecipitation（A）pCXUN-HA::ZmFAH载体构建，ZmFAHCDS区扩增（图3A左1）及GV3101菌落PCR（图3A右1-3）M，DL2000DNAMaker（B）pCXUN-Myc::ZmFBL41B73LRR载体构建，LRR片段扩增（图3B左1）GV3101菌落PCR（图3B右1-3）M，DL2000DNAMaker（C）蛋白免疫印记检测Co-ip结果(A)VectorconstructionofpCXUN-HA::ZmFAH，CDSamplificationofZmFAH(leftinFig.3A1)andPCRdetectionofAgrobacteriumGV3101(rightinFig.3A1-4)M,DL2000DNAMaker(B)VectorconstructionofpCXUN-Myc::ZmFBL41B73LRR，CDSamplificationofpCXUN-Myc::ZmFBL41B73LRR(leftinFig.3B1)andPCRdetectionofAgrobacteriumGV3101(rightinFig.3B1-4)M,DL2000DNAMaker(C)Co-IPresultofwesternblotting3.4Pull-down实验验证ZmFBL41蛋白与ZmFAH蛋白的直接互作为进一步证明ZmFBL41蛋白与ZmFAH蛋白的直接互作，将ZmFAH构建到pMAL-c2x载体中，将ZmFBL41构建到pET-28a载体中；分别导入原核表达菌株BL21DE3大肠杆菌（图4AZmFAH1365bp，BZmFBL411008bp）。经活化、扩大培养、蛋白诱导、蛋白表达、细胞破碎、蛋白收集，通过SDS-PAGE电泳及考马斯亮蓝染色确定各蛋白正常表达（图4C）。将ZmFAH-MBP和ZmFB
本文编号：3339551
【文章来源】：山东农业大学山东省
【文章页数】：55 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
候选基因CDS区扩增Fig.1CDSamplificationofcandidategenes
ZmFBL41互作蛋白ZmFAH在玉米纹枯病抗性中的功能验证26ZmFBL41B73LRR诱饵载体同时导入Y2HGold菌株中，以pGADT7载体与pGBKT7::ZmFBL41B73LRR同时转化Y2HGold菌株作为阴性对照。所有转化酵母涂布到SD/-Trp-Leu培养基上筛选培养，将阳性酵母菌株扩大培养，依次按照浓度梯度对应加到SD/-Trp-Leu和SD/-Ade-His-Trp-Leu培养基上继续培养。结果（图2）显示：在SD/-Trp-Leu培养基上所有酵母菌株都能够正常生长，而在SD/-Ade-His-Trp-Leu培养基上只有同时转有pGBKT7::ZmFBL41B73LRR和pGADT7::ZmFAH载体的酵母菌株正常生长，而转有其他三个蛋白的酵母菌株不能生长，说明ZmFAH蛋白能够与ZmFBL41的LRR结构域互作，因此将ZmFAH蛋白作为候选蛋白进行深入研究。图2酵母双杂交验证ZmFBL41蛋白LRR结构域与候选蛋白的互作Fig.2ValidationoftheinteractionbetweentheLRRdomainofZmFBL41andeachcandidateproteinsusingyeasttwo-hybridization3.3免疫共沉淀实验验证ZmFBL41蛋白LRR结构域与ZmFAH蛋白互作首先将ZmFBL41B73LRR构建到pCXUN-Myc载体中，将ZmFAH构建到pCXUN-HA载体中，分别导入到农杆菌GV3101，利用载体引物Ubi-F和片段自身引物通过PCR对农杆菌进行进一步确认（图3A左ZmFAH1365bp，右1465bp图3B左ZmFBL41B73LRR323bp，右423bp）。利用农杆菌介导的烟草瞬时表达技术在本生烟叶片中表达ZmFBL41蛋白的LRR结构域和ZmFAH蛋白，提取总蛋白后进行免疫共沉淀并通过western
山东农业大学硕士学位论文27blotting进行检测。结果表明（图3C），在Input样品中，对照组和实验组均能够检测到相应的蛋白条带，说明蛋白均被正常表达；经HA磁珠的IP操作后，实验组检测到ZmFAH-HA蛋白，也检测到了ZmFBL41B73LRR-Myc蛋白；而对照组仅检测到ZmFBL41B73LRR蛋白，没有检测到ZmFAH-HA蛋白，该结果证明了ZmFBL41蛋白的LRR结构域在体内也能够与ZmFAH互作。图3免疫共沉淀实验验证ZmFBL41B73LRR与ZmFAH的互作Fig.3TheinteractionbetweenZmFBL41B73LRRandZmFAHwasverifiedbyco-immunocoprecipitation（A）pCXUN-HA::ZmFAH载体构建，ZmFAHCDS区扩增（图3A左1）及GV3101菌落PCR（图3A右1-3）M，DL2000DNAMaker（B）pCXUN-Myc::ZmFBL41B73LRR载体构建，LRR片段扩增（图3B左1）GV3101菌落PCR（图3B右1-3）M，DL2000DNAMaker（C）蛋白免疫印记检测Co-ip结果(A)VectorconstructionofpCXUN-HA::ZmFAH，CDSamplificationofZmFAH(leftinFig.3A1)andPCRdetectionofAgrobacteriumGV3101(rightinFig.3A1-4)M,DL2000DNAMaker(B)VectorconstructionofpCXUN-Myc::ZmFBL41B73LRR，CDSamplificationofpCXUN-Myc::ZmFBL41B73LRR(leftinFig.3B1)andPCRdetectionofAgrobacteriumGV3101(rightinFig.3B1-4)M,DL2000DNAMaker(C)Co-IPresultofwesternblotting3.4Pull-down实验验证ZmFBL41蛋白与ZmFAH蛋白的直接互作为进一步证明ZmFBL41蛋白与ZmFAH蛋白的直接互作，将ZmFAH构建到pMAL-c2x载体中，将ZmFBL41构建到pET-28a载体中；分别导入原核表达菌株BL21DE3大肠杆菌（图4AZmFAH1365bp，BZmFBL411008bp）。经活化、扩大培养、蛋白诱导、蛋白表达、细胞破碎、蛋白收集，通过SDS-PAGE电泳及考马斯亮蓝染色确定各蛋白正常表达（图4C）。将ZmFAH-MBP和ZmFB
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