金黄色葡萄球菌肠毒素U的纯化、检测及其诱发乳腺上皮细胞炎症的初探
发布时间：2021-08-13 05:52
奶牛乳房炎是奶牛养殖中最常见、危害最为巨大的疾病之一,金黄色葡萄球菌是奶牛乳房炎的主要致病菌之一,其引发的乳房炎具有致病后难以治愈的特点。肠毒素是金黄色葡萄球菌重要的毒力因子,具有超抗原活性,与引起奶牛乳房炎的金黄色葡萄球菌的致病性密切相关,多项流行病学调查显示,肠毒素seu基因在奶牛乳房炎样本中检出。基于seu基因的流行性,本研究从奶牛源金黄色葡萄球菌中克隆了seu基因、表达并纯化了金黄色葡萄球菌肠毒素U蛋白（SEU）,建立了检测SEU蛋白水平的ELISA方法以及探索了SEU对牛乳腺上皮细胞增殖和细胞炎性因子分泌的影响。主要研究内容如下:（1）克隆了seu基因。本研究分离了奶牛源金黄色葡萄球菌、提取了细菌基因组DNA,设计引物并克隆了金黄色葡萄球菌肠毒素U的特异性基因seu的基因片段并连接至pMD19-T克隆载体,通过生物信息学分析方法,对seu基因及其编码的氨基酸序列进行分析,预测了SEU蛋白的基本理化特性以及蛋白信号肽和跨膜区域。结果表明,成功获得了长度为786 bp的金黄色葡萄球菌seu克隆片段,分析得知SEU蛋白由261个氨基酸组成,相对分子量约为30.53 kDa,分子式为...
【文章来源】：西南民族大学四川省
【文章页数】：70 页
【学位级别】：硕士
【图文】：
PCR鉴定金黄色100bp100b
金黄色葡萄球菌肠毒素U的纯化、检测及其诱发乳腺上皮细胞炎症的初探18(1)(2)图2-2SEU蛋白跨膜区域及信号肽分析Figure.2-2SignalpeptideandtransmembraneregionpredictionofSEU2-2-(1)SEU跨膜区结构分析transmembrane：跨膜区；inside：胞内区；outside胞外区2-2-(2)SEU蛋白信号肽预测C-score：酶切位点分值；S-score：信号肽分值；Y-score：综合参数分值2.4讨论本研究对金黄色葡萄球菌肠毒素SEU的特异性基因seu及其编码的氨基酸序列进行了基本的序列、分子特征等生物信息学分析，预测了SEU蛋白的基本物理及化学参数、氨基酸跨膜区域及信号肽成分等信息，了解到该蛋白的基本信息，并使用PCR扩增技术获得了seu基因的克隆片段，将该基因片段连接至克隆载体pMD19-T并导入E.coliDH5α完成转化扩增，成功构建了pMD19-T-seu重组克隆载体，为后续研究打下基矗2.5小结本研究从金黄色葡萄球菌株中使用PCR扩增技术克隆了长度为786bp的seu基因片段、构建了pMD19-T-seu克隆载体，对金黄色葡萄球菌肠毒素SEU进行了生物信息学分析，得知SEU蛋白是由261个氨基酸组成，相对分子量约为30.53kDa，总原子数目为4243，分子式为C1365H2095N355O415S13。理论等电点PI为6.66，总平均亲水性为-0.675，表明其性质是一个碱性亲水的蛋白质。体外半衰期为大于10h，不稳定系数为33.97，表明该SEU是结构较稳定的蛋白质。在线分析工具预测氨基酸跨膜区域及信号肽成分得知，SEU蛋白不存在跨膜区，是一个膜外蛋白，第1~17个氨基酸为信号肽成分。
金黄色葡萄球菌肠毒素U的纯化、检测及其诱发乳腺上皮细胞炎症的初探263.3实验结果3.3.1seu原核表达载体pET-30a(+)-seu的构建与鉴定将PCR扩增得到的seu基因片段经T载体克隆与双酶切反应连接至pET-30a(+)载体，转化E.coliDH5α感受态细胞后筛选得到单克隆，以单克隆落于无菌水后所得悬浊液作为DNA模版进行菌落PCR扩增seu基因，并对单克隆增菌后提取的重组载体进行测序，结果表明，菌落PCR扩增所得条带与预期相符，见图3-1。重组pET-30a(+)-seu载体经序列测序后，与NCBI数据库进行比对，得知扩增所得seu基因片段与登录ID为AY205307.1的Staphylococcusaureusstrain383F菌株的enterotoxinSEU(seu)核苷酸序列中第127至912位处碱基相似率达99%，表明seu基因原核表达载体pET-30a(+)-seu构建成功。图3-1菌落PCR鉴定seuFigure.3-1IdentificationforseubycolonyPCRM：DNAMarkerDL2000；1：阴性对照；2~5：pET-30a(+)-seu质粒转化单菌落；箭头标识为seu基因目的条带所在位置3.3.2重组蛋白原核表达3.3.2.1选择高原核表达工程菌株将鉴定正确的重组载体质粒pET-30a(+)-seu转化至表达工程菌BL21(DE3)及BL21(DE3)pLysS感受态细胞后使用IPTG进行诱导表达，并对所收集菌体裂解后所得沉淀及上清液进行SDS-PAGE检测，图3-2结果表明重组蛋白质主要存在于上清液中，其分子量大小与预期相符，说明目的蛋白SEU以可溶性形式成功表达。750bp500bp2000bp1000bp250bp100bp
【参考文献】：
期刊论文
[1]中草药治疗奶牛乳房炎研究进展[J]. 郭玮,周海柱. 畜禽业. 2019(12)
[2]金黄色葡萄球菌中毒性休克综合征毒素-1 PCR检测方法的建立与初步应用[J]. 张晓丽,陈卓,于佳鑫,孙悦青,王洋,栾剑,周晓梅,郭海勇. 河北农业大学学报. 2019(06)
[3]奶牛乳房炎的研究进展[J]. 高春生,白翠,马晓媛,吴丹,王楠,于钦磊. 吉林畜牧兽医. 2019(11)
[4]金黄色葡萄球菌致病毒素基因分布及与致病性的相关性分析[J]. 燕瑞英. 临床研究. 2019(08)
[5]奶牛乳房炎的病因分析、诊断技术及防治措施[J]. 陈松林,李雨来. 现代畜牧科技. 2019(07)
[6]直接竞争ELISA法检测动物源食品中利巴韦林残留[J]. 刘卫华,沙芳芳,李润磊,王鑫伟,王向红. 食品工业科技. 2019(09)
[7]奶牛乳房炎的综述[J]. 林益史,刘梦佳,滕明明,李虎强,张耀相. 畜牧兽医杂志. 2018(06)
[8]奶牛乳房炎的发病原因及防治方法[J]. 贾登菊. 甘肃畜牧兽医. 2018(05)
[9]京津冀地区中小规模奶牛场隐性乳房炎状况调查[J]. 张瑞强,史良玉,王迪,米思远,张毅,丁向东,唐韶青,肖炜,俞英. 中国奶牛. 2018(04)
[10]中草药对奶牛乳房炎的防治作用[J]. 孙志敏. 畜牧兽医科技信息. 2017(12)
博士论文
[1]金黄色葡萄球菌耐热核酸酶相关基因的功能与特征分析[D]. 唐俊妮.华中农业大学 2007
[2]奶牛乳腺炎金黄色葡萄球菌毒力因子的克隆表达及生物活性研究[D]. 杨宏军.山东农业大学 2007
硕士论文
[1]金葡菌超抗原毒素对小鼠乳腺的致病作用[D]. 崔腾腾.吉林农业大学 2017
[2]清热解毒药抗金黄色葡萄球菌黏附乳腺上皮细胞机理研究[D]. 谷静娟.新疆农业大学 2014
[3]金黄色葡萄球菌毒力分型及其毒素致乳腺上皮细胞凋亡的研究[D]. 王飞.山东师范大学 2011
[4]金黄色葡萄球菌及其肠毒素基因分布的研究[D]. 王营.河北农业大学 2010
[5]葡萄球菌分离株肠毒素基因型分析及两种毒素的表达纯化[D]. 李琳.天津大学 2009
[6]奶牛乳腺炎三联灭活苗的研制及其免疫效力评价[D]. 曹丙蕾.山东农业大学 2007
[7]奶牛乳房炎基因工程亚单位疫苗实验免疫研究[D]. 崔焕忠.吉林农业大学 2004
本文编号：3339880
【文章来源】：西南民族大学四川省
【文章页数】：70 页
【学位级别】：硕士
【图文】：
PCR鉴定金黄色100bp100b
金黄色葡萄球菌肠毒素U的纯化、检测及其诱发乳腺上皮细胞炎症的初探18(1)(2)图2-2SEU蛋白跨膜区域及信号肽分析Figure.2-2SignalpeptideandtransmembraneregionpredictionofSEU2-2-(1)SEU跨膜区结构分析transmembrane：跨膜区；inside：胞内区；outside胞外区2-2-(2)SEU蛋白信号肽预测C-score：酶切位点分值；S-score：信号肽分值；Y-score：综合参数分值2.4讨论本研究对金黄色葡萄球菌肠毒素SEU的特异性基因seu及其编码的氨基酸序列进行了基本的序列、分子特征等生物信息学分析，预测了SEU蛋白的基本物理及化学参数、氨基酸跨膜区域及信号肽成分等信息，了解到该蛋白的基本信息，并使用PCR扩增技术获得了seu基因的克隆片段，将该基因片段连接至克隆载体pMD19-T并导入E.coliDH5α完成转化扩增，成功构建了pMD19-T-seu重组克隆载体，为后续研究打下基矗2.5小结本研究从金黄色葡萄球菌株中使用PCR扩增技术克隆了长度为786bp的seu基因片段、构建了pMD19-T-seu克隆载体，对金黄色葡萄球菌肠毒素SEU进行了生物信息学分析，得知SEU蛋白是由261个氨基酸组成，相对分子量约为30.53kDa，总原子数目为4243，分子式为C1365H2095N355O415S13。理论等电点PI为6.66，总平均亲水性为-0.675，表明其性质是一个碱性亲水的蛋白质。体外半衰期为大于10h，不稳定系数为33.97，表明该SEU是结构较稳定的蛋白质。在线分析工具预测氨基酸跨膜区域及信号肽成分得知，SEU蛋白不存在跨膜区，是一个膜外蛋白，第1~17个氨基酸为信号肽成分。
金黄色葡萄球菌肠毒素U的纯化、检测及其诱发乳腺上皮细胞炎症的初探263.3实验结果3.3.1seu原核表达载体pET-30a(+)-seu的构建与鉴定将PCR扩增得到的seu基因片段经T载体克隆与双酶切反应连接至pET-30a(+)载体，转化E.coliDH5α感受态细胞后筛选得到单克隆，以单克隆落于无菌水后所得悬浊液作为DNA模版进行菌落PCR扩增seu基因，并对单克隆增菌后提取的重组载体进行测序，结果表明，菌落PCR扩增所得条带与预期相符，见图3-1。重组pET-30a(+)-seu载体经序列测序后，与NCBI数据库进行比对，得知扩增所得seu基因片段与登录ID为AY205307.1的Staphylococcusaureusstrain383F菌株的enterotoxinSEU(seu)核苷酸序列中第127至912位处碱基相似率达99%，表明seu基因原核表达载体pET-30a(+)-seu构建成功。图3-1菌落PCR鉴定seuFigure.3-1IdentificationforseubycolonyPCRM：DNAMarkerDL2000；1：阴性对照；2~5：pET-30a(+)-seu质粒转化单菌落；箭头标识为seu基因目的条带所在位置3.3.2重组蛋白原核表达3.3.2.1选择高原核表达工程菌株将鉴定正确的重组载体质粒pET-30a(+)-seu转化至表达工程菌BL21(DE3)及BL21(DE3)pLysS感受态细胞后使用IPTG进行诱导表达，并对所收集菌体裂解后所得沉淀及上清液进行SDS-PAGE检测，图3-2结果表明重组蛋白质主要存在于上清液中，其分子量大小与预期相符，说明目的蛋白SEU以可溶性形式成功表达。750bp500bp2000bp1000bp250bp100bp
【参考文献】：
期刊论文
[1]中草药治疗奶牛乳房炎研究进展[J]. 郭玮,周海柱. 畜禽业. 2019(12)
[2]金黄色葡萄球菌中毒性休克综合征毒素-1 PCR检测方法的建立与初步应用[J]. 张晓丽,陈卓,于佳鑫,孙悦青,王洋,栾剑,周晓梅,郭海勇. 河北农业大学学报. 2019(06)
[3]奶牛乳房炎的研究进展[J]. 高春生,白翠,马晓媛,吴丹,王楠,于钦磊. 吉林畜牧兽医. 2019(11)
[4]金黄色葡萄球菌致病毒素基因分布及与致病性的相关性分析[J]. 燕瑞英. 临床研究. 2019(08)
[5]奶牛乳房炎的病因分析、诊断技术及防治措施[J]. 陈松林,李雨来. 现代畜牧科技. 2019(07)
[6]直接竞争ELISA法检测动物源食品中利巴韦林残留[J]. 刘卫华,沙芳芳,李润磊,王鑫伟,王向红. 食品工业科技. 2019(09)
[7]奶牛乳房炎的综述[J]. 林益史,刘梦佳,滕明明,李虎强,张耀相. 畜牧兽医杂志. 2018(06)
[8]奶牛乳房炎的发病原因及防治方法[J]. 贾登菊. 甘肃畜牧兽医. 2018(05)
[9]京津冀地区中小规模奶牛场隐性乳房炎状况调查[J]. 张瑞强,史良玉,王迪,米思远,张毅,丁向东,唐韶青,肖炜,俞英. 中国奶牛. 2018(04)
[10]中草药对奶牛乳房炎的防治作用[J]. 孙志敏. 畜牧兽医科技信息. 2017(12)
博士论文
[1]金黄色葡萄球菌耐热核酸酶相关基因的功能与特征分析[D]. 唐俊妮.华中农业大学 2007
[2]奶牛乳腺炎金黄色葡萄球菌毒力因子的克隆表达及生物活性研究[D]. 杨宏军.山东农业大学 2007
硕士论文
[1]金葡菌超抗原毒素对小鼠乳腺的致病作用[D]. 崔腾腾.吉林农业大学 2017
[2]清热解毒药抗金黄色葡萄球菌黏附乳腺上皮细胞机理研究[D]. 谷静娟.新疆农业大学 2014
[3]金黄色葡萄球菌毒力分型及其毒素致乳腺上皮细胞凋亡的研究[D]. 王飞.山东师范大学 2011
[4]金黄色葡萄球菌及其肠毒素基因分布的研究[D]. 王营.河北农业大学 2010
[5]葡萄球菌分离株肠毒素基因型分析及两种毒素的表达纯化[D]. 李琳.天津大学 2009
[6]奶牛乳腺炎三联灭活苗的研制及其免疫效力评价[D]. 曹丙蕾.山东农业大学 2007
[7]奶牛乳房炎基因工程亚单位疫苗实验免疫研究[D]. 崔焕忠.吉林农业大学 2004
本文编号：3339880
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