猪细小病毒感染PK-15细胞前后microRNAs表达谱的研究及部分免疫功能的鉴定

发布时间：2017-04-29 06:03

  本文关键词：猪细小病毒感染PK-15细胞前后microRNAs表达谱的研究及部分免疫功能的鉴定，，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：猪细小病毒(PPV)是引起母猪繁殖障碍性疾病的重要病原之一。此外,PPV还能引起仔猪腹泻、皮炎以及呼吸系统疾病,在猪非化脓性心肌炎、猪消瘦综合症和仔猪断奶多系统衰竭综合症等疾病中也发挥着重要的作用。全球普遍存在着猪细小病毒病,严重影响养猪业的发展,对其造成了巨大的经济损失。MicroRNAs是一类由内源基因编码的长度为19-24nt的单链RNA分子,其通过与靶基因mRNA 3'UTR相互作用,在病毒的侵染、细胞的增殖分化及凋亡、肿瘤的发生、体内平衡等许多生物学过程中起着重要的调控作用。目前,关于细胞miRNAs调节病毒感染的研究已有报道,其中包括乙型脑炎病毒,猪繁殖与呼吸综合症病毒,丙型肝炎病毒,A型流感病毒,猪瘟病毒等,但对于PPV感染PK-15细胞诱导细胞miRNAs表达却未见报道。为了探究细胞miRNAs在PPV感染中的作用,本试验通过测定PPV的TCID50,在刚贴壁的PK-15细胞中按照1个MOI接种PPV,并于感染24h后对细胞进行总RNA的抽提,通过Solexa高通量测序方法筛选出符合要求的miRNAs,并对PPV感染前后细胞miRNAs的表达量进行测定。同时根据PPV NS1的保守序列设计了一对荧光定量检测引物,建立了PPV荧光定量PCR方法。通过软件预测能靶向PPV基因组的miRNAs,并将其与免疫有关的miRNAs共同转染PK-15细胞,运用建立的荧光定量方法对其功能进行了验证。通过Solexa高通量测序结果表明,共有476条miRNAs在PPV感染前后表达量有所改变,其中240条miRNAs是对照组数据库所特有的,13条miRNAs是试验组数据库所特有的。对建立的细胞miRNAs表达谱进行分析发现,共有182条miRNAs差异表达,其中60条miRNAs属于上调表达,122条miRNAs属于下调表达。miR-21是表达量最大的,而miR-10b是差异最大的。对差异表达的miRNAs的靶标进行预测发现,C-JUN、MyD88、TLR7等与免疫有关的基因被预测出来,这结果表明这些差异表达的miRNAs可能参与PPV感染过程。通过实时荧光定量验证了随机挑选的10个差异表达的miRNAs,其结果全部与Solexa高通量测序结果致。所建立的荧光定量PCR最佳退火温度为59℃,其在1.59×109-1.59×104copies/μL可得到较为理性的标准曲线,相关系数R2为0.997,扩增效率为97.2%,且其特异性和重复性都很好,能被运用于miRNAs 功能试验的验证。PPV基因组靶标预测结果显示,miR-34a能靶向PPV NS1的编码区,且该编码区在PPV病毒中属于高度保守序列。荧光定量PCR结果显示,miR-34a能抑制PPV的复制,而其他的miRNAs则不能,但其具体的抑制机制仍需要进一步的研究。本试验成功构建了猪PK-15细胞的小RNA数据库,并建立了PPV感染前后细胞miRNAs的表达谱,对其差异表达的miRNAs及其靶标分析,有助于在miRNAs的层面上了解PPV感染机制以及宿主抗病毒免疫的分子机制。本试验同时也证实了miR-34a能抑制猪细小病毒的复制,这为PPV的防治提供了一条新思路。
【关键词】：猪细小病毒 miRNAs PK-15细胞 NS1基因
【学位授予单位】：四川农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S858.28
【目录】：

• 中文摘要4-6
• Abstract6-8
• 缩略词8-12
• 第一部分 文献综述及研究的目的与意义12-26
• 一 文献综述12-25
• 1 细小病毒概述12
• 2 猪细小病毒概述12-18
• 2.1 猪细小病毒的病原学12-14
• 2.2 猪细小病毒的分子生物学特性14-16
• 2.2.1 猪细小病毒的基因组结构14-15
• 2.2.2 猪细小病毒的DNA复制15
• 2.2.3 猪细小病毒编码的蛋白及功能15-16
• 2.2.4 猪细小病毒的致病机制16
• 2.3 猪细小病毒的流行病学16-17
• 2.4 猪细小病毒的防制17-18
• 3 MicroRNAs的概述18-23
• 3.1 MicroRNAs的发现18
• 3.2 MicroRNAs的合成18-19
• 3.3 MicroRNAs的作用机制19-20
• 3.4 MicroRNAs的研究方法20-21
• 3.5 microRNAs基因预测和靶基因预测21
• 3.6 MicroRNAs与免疫21-23
• 4 microRNAs在宿主-病毒中的作用23-25
• 二 研究的目的与意义25-26
• 第二部分 试验部分26-54
• 第一章 PK-15细胞microRNAs数据库的建立及与PPV有关的microRNAs的分析26-40
• 1 材料26-27
• 1.1 细胞及毒株26
• 1.2 主要试剂及仪器26
• 1.3 主要试剂的配置26-27
• 2 方法27-31
• 2.1 PK-15细胞的传代培养27
• 2.2 TCID_(50)的测定27
• 2.3 PPV感染27
• 2.4 细胞总RNA的提取27-28
• 2.5 PK-15细胞microRNAs数据库的建立28-29
• 2.5.1 细胞样品RNA的提取及鉴定28
• 2.5.2 数据库的建立及高通量测序28
• 2.5.3 miRNAs的筛选28-29
• 2.6 miRNAs荧光定量的验证29-31
• 3 结果31-37
• 3.1 TCID_(50)检测结果31-32
• 3.2 PPV感染PK-15细胞32
• 3.3 RNA样品的检测32-33
• 3.4 高通量测序结果统计33-35
• 3.5 差异表达的miRNAs及其靶基因的预测35-36
• 3.6 荧光定量验证结果36-37
• 4 讨论37-39
• 5 小结39-40
• 第二章 PPV荧光定量方法的建立及部分miRNAs功能验证40-54
• 1 材料40-41
• 1.1 细胞、菌株及毒株40
• 1.2 生物试剂及器材40
• 1.3 主要试剂的配制40-41
• 2 方法41-45
• 2.1 PPV引物合成41
• 2.2 PPV DNA抽提41-42
• 2.3 标准质粒的构建42-43
• 2.3.1 荧光定量PCR扩增与产物的回收42
• 2.3.2 感受态细胞的制备42-43
• 2.3.3 连接与转化43
• 2.3.4 质粒的抽提与鉴定43
• 2.4 荧光定量PCR43-44
• 2.4.1 PPV荧光定量标准曲线的绘制43-44
• 2.4.2 重复性和特异性44
• 2.5 miRNAs靶标的预测与功能的验证44-45
• 2.5.1 靶标的预测及miRNAs筛选44
• 2.5.2 转染44-45
• 2.5.3 荧光定量检测45
• 3 结果45-51
• 3.1 PPV荧光定量引物检测45-46
• 3.2 重组质粒构建及测序46-47
• 3.3 荧光定量PCR标准曲线绘制47
• 3.4 荧光定量PCR重复性和特异性47-48
• 3.5 靶标预测与功能验证48-51
• 4 讨论51-52
• 5 小结52-54
• 参考文献54-66
• 致谢66-67
• 附表67-80
• 攻读学位期间发表的学术论文目录80

【相似文献】

中国期刊全文数据库 前10条

1 ;Small but influential:the role of microRNAs on gene regulatory network and 3′UTR evolution[J];遗传学报;2009年01期

2 B.SAILAJA;S.R.VOLETI;D.SUBRAHMANYAM;N.SARLA;V.VISHNU PRASANTH;V.P.BHADANA;S.K.MANGRAUTHIA;;Prediction and Expression Analysis of miRNAs Associated with Heat Stress in Oryza sativa[J];Rice Science;2014年01期

3 罗书芳;崔浪军;王健;屈生宪;;干旱胁迫下15种丹参miRNAs差异表达分析[J];广东农业科学;2013年05期

4 郝力力;李必富;;应用荧光定量PCR对细粒棘球绦虫miRNAs在虫体不同发育阶段表达量的研究[J];中国农学通报;2012年26期

5 Liming Ma;Lianghu Qu;;The Function of MicroRNAs in Renal Development and Pathophysiology[J];遗传学报;2013年04期

6 Gang Wu;;Plant MicroRNAs and Development[J];Journal of Genetics and Genomics;2013年05期

7 Xiang-Shun Cui;Xing-Hui Shen;Shao-Chen Sun;Sun-Wha Cho;Young-Tae Heo;Yong-Kook Kang;Teruhiko Wakayama;Nam-Hyung Kim;;Identifying MicroRNA and mRNA Expression Profiles in Embryonic Stem Cells Derived from Parthenogenetic,Androgenetic and Fertilized Blastocysts[J];遗传学报;2013年04期

8 叶瑞松;习欠云;束刚;王丽娜;王松波;朱晓彤;高萍;江青艳;张永亮;;GnRH引起猪垂体细胞miRNAs表达谱变化[J];畜牧与兽医;2012年S1期

9 陶新;徐子伟;;miRNAs对肠道健康的调控作用及机理[J];动物营养学报;2013年09期

10 郝力力;李锐;李必富;;细粒棘球绦虫miRNAs的鉴定及分析[J];浙江农业学报;2012年04期

中国重要会议论文全文数据库 前10条

1 ;A potential role for Chlamydomonas miRNAs in response to environmental changes[A];中国遗传学会植物遗传和基因组学专业委员会2009年学术研讨会论文摘要汇编[C];2009年

2 Ping Xuan;Maozu Guo;Yangchao Huang;;MaturePred:Efficient Identification of MicroRNAs within Novel Plant Pre-miRNAs[A];第五届全国生物信息学与系统生物学学术大会论文集[C];2012年

3 Zhen-Dong Xiao;Li-Ting Diao;Jian-Hua Yang;Hui Xu;Mian-Bo Huang;Yong-Jin Deng;Hui Zhou;Liang-Hu Qu;;Systematical identification of cis-elements orchestrating the expressions of miRNAs in humans[A];生命的分子机器及其调控网络——2012年全国生物化学与分子生物学学术大会摘要集[C];2012年

4 ;Cell-free miRNAs may indicate diagnosis and docetaxel sensitivity of tumor cells in malignant effusions[A];2011医学科学前沿论坛第十二届全国肿瘤药理与化疗学术会议论文集[C];2011年

5 任波;马迪;李毅;;地高辛标记探针结合化学发光技术快速灵敏检测植物总RNA中的miRNAs方法[A];中国植物病理学会2005年学术年会暨植物病理学报创刊50周年纪念会论文摘要集[C];2005年

6 任波;马迪;李毅;;地高辛标记探针结合化学发光技术快速灵敏检测植物总RNA中的miRNAs方法[A];中国植物病理学会2005年学术年会暨植物病理学报创刊50周年纪念会论文集[C];2005年

7 戚鹏;韩金祥;鲁艳芹;王传玺;栾中华;卜范峰;;病毒编码的miRNAs:基因表达新的调控因子[A];山东省药学会2006年生化与生物技术药物学术研讨会论文集[C];2006年

8 ;Bioinformatic identification and expression analysis of new microRNAs from Medicago truncatula[A];华东六省一市生物化学与分子生物学会2008年学术交流会论文摘要汇编[C];2008年

9 ;Cell-free miRNAs may indicate diagnosis and docetaxel sensitivity of tumor cells in malignant effusions[A];中华医学会肿瘤学分会第七届全国中青年肿瘤学术会议——中华医学会肿瘤学分会“中华肿瘤 明日之星”大型评选活动暨中青年委员全国遴选论文汇编[C];2011年

10 ;miRNAs involved in Tau expression of BMSCs induced neurons[A];中国神经科学学会第九届全国学术会议暨第五次会员代表大会论文摘要集[C];2011年

中国重要报纸全文数据库 前1条

1 江尚;特异性miRNAs与前列腺癌发病密切相关[N];中国医药报;2007年

中国博士学位论文全文数据库 前10条

1 陈健德;新生儿脓毒症miRNAs表达谱及其免疫调节作用研究[D];复旦大学;2014年

2 A.B.M.Khaldun;[D];中国科学院研究生院(武汉植物园);2015年

3 成鹰;大肠杆菌和布鲁氏菌脂多糖刺激条件下巨噬细胞差异表达miRNAs的鉴定及其作用机制[D];海南大学;2014年

4 王奕;MiRNAs在白癜风外周血单个核细胞中的表达及miR-3940-5p对T细胞作用机制的研究[D];山东大学;2015年

5 陈科;小鼠子宫内膜mRNAs和miRNAs时空表达与胚胎着床的关系及SPOP对基质细胞蜕膜化的影响[D];重庆医科大学;2015年

6 陈芳;鹅肥肝生成相关miRNAs、基因的鉴定及功能研究和就巢性相关miRNAs的鉴定[D];南京农业大学;2014年

7 顾丽红;北京鸭胚胎期胸肌发育相关基因与miRNAs表达模式鉴定及其互作关系研究[D];西北农林科技大学;2015年

8 于鹏;miRNAs对骨髓间充质干细胞分化的影响[D];北京协和医学院;2013年

9 吴绍华;不同倍性水稻miRNAs及其靶基因的鉴定与表达分析[D];四川农业大学;2011年

10 陈毅鹏;酒精性肝病特异性miRNAs表达谱及下游调控基因研究[D];浙江大学;2014年

中国硕士学位论文全文数据库 前10条

1 姜青华;丹参miRNAs组织特异表达谱及其靶基因鉴定[D];杭州师范大学;2015年

2 刘元会;抑郁患者脑脊液和血清中差异性miRNAs鉴定的临床研究[D];四川医科大学;2015年

3 贾文慧;宫颈癌及子宫内膜癌血清miRNAs的研究[D];南京大学;2013年

4 许成辰;不同HER-2水平的人乳腺癌MCF-7细胞内miRNAs表达谱及相关miRNAs对癌细胞生物学行为的影响[D];安徽医科大学;2015年

5 曹文婷;奶山羊乳腺组织miRNAs的鉴定、筛选及功能的初步研究[D];西北农林科技大学;2015年

6 刘帅帅;循环miRNAs检测对肝癌诊断价值的meta分析[D];蚌埠医学院;2015年

7 王蕊;喉癌相关miRNAs的筛选及其功能的初步研究[D];南华大学;2015年

8 雷彬;大白猪和二花脸猪排卵前卵泡差异表达miRNAs及其靶基因鉴定[D];华中农业大学;2013年

9 葛莹;绵羊不同发情状态下松果体若干miRNAs表达差异及其与AANAT靶关系鉴定[D];扬州大学;2015年

10 汤自征;RA-FLS的迁移、侵袭及RA相关miRNAs表达水平的检测[D];扬州大学;2015年

  本文关键词：猪细小病毒感染PK-15细胞前后microRNAs表达谱的研究及部分免疫功能的鉴定，由笔耕文化传播整理发布。

本文编号：334306