MDCK细胞中粘附蛋白的筛选及CDH1胞间粘附的验证
发布时间：2021-09-02 23:48
流感的爆发严重威胁人类的健康和经济的发展,现代流感疫苗的生产更趋向基于无血清悬浮细胞的工艺。MDCK细胞系是公认为最适合甲、乙型流感病毒疫苗生产的三大细胞系之一,但该细胞固有贴壁依赖性,为了避免细胞悬浮驯化过程中由于传代数目过多,导致用于大规模疫苗生产的细胞活性和增值效率降低,结团率升高这一问题,利用基因工程手段,有针对性地改造细胞表面粘附分子,抑制细胞的粘附性状,构建MDCK悬浮细胞系,将更符合现代疫苗生产需求。目前有关MDCK细胞上发挥粘附功能的有效蛋白及其粘附机制的研究少有报道,所以找出MDCK细胞表面的主要粘附蛋白并对其编码基因的表达进行抑制或敲除是解决问题的关键。本研究通过iTRAQ（Isobaric tag for relative and absolute quantitation）定量蛋白质组学分析技术,将本实验室驯化获得的MDCK悬浮细胞与相同来源的MDCK贴壁细胞进行差异蛋白分析,筛选MDCK细胞上可能与粘附相关的蛋白,选择了其中经典的粘附分子E-钙粘蛋白（E-Cadherin,CDH1）,E-钙粘蛋白的编码基因为CDH1基因,通过RNA干扰技术构建CDH1低表达的...
【文章来源】：西北民族大学甘肃省
【文章页数】：64 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
甲型，乙型，丙型流感病毒结构示意图[42]
19图2.1MDCKADH和MDCKSUS细胞差异蛋白的火山分析图和聚类分析图A.火山图代表MDCKADH与MDCKSUS细胞统计分析中蛋白质水平的差异显著性和差异倍数，绿点是差异显著的蛋白质B.热图代表MDCKADH与MDCKSUS细胞统计学分析中差异显著的蛋白质，以MDCKADH细胞为对照，MDCKSUS细胞蛋白质表达差异倍数以颜色区分，蓝色代表表达量下调的蛋白，红色代表表达量上调的蛋白Fig.2.1MDCKADHandMDCKSUScellsdifferentialproteinvolcanoanalysisdiagramandclusteranalysisdiagramA.ThevolcanographrepresentsthedifferenceandmultipleoftheproteinlevelinthestatisticalanalysisofMDCKADHandMDCKSUScells.ThegreendotistheproteinwithsignificantdifferenceB.HeatmaprepresentsproteinswithsignificantdifferencesinthestatisticalanalysisofMDCKADHandMDCKSUScells.MDCKADHcellsisacontrol.ThedifferenceinMDCKSUScellsproteinexpressioniscolor-coded.Bluerepresentsproteinswithdown-regulatedexpressionandredrepresentsproteinswithup-regulatedexpression3.2GeneOntology（GO）富集分析GeneOntology（GO）是一个拥有持续更新的标准化词汇表来对基因功能进行标准化分类的系统，该系统从三个方面对生物体中的基因及其产物的属性进行描述：分子功能（MolecularFunction）、细胞组分（CellularComponent）和生物过程（BiologicalProcess）。通过Fisher精确检验来评价GO注释的显著性富集分析，本实验GO富集分析中，总共有1250个GO注释，检测了643个差异表达的蛋白质。每组中排名靠前的10个GO注释，由它们之间的差异P值确定（如图2.2）。以MDCKADH细胞为对照，通过驯化获得的MDCKSUS细胞在“生物过程”组中，鉴定出的许多蛋白质都参与细胞代谢的过程，分析表明?
20理过程[149,150]，分析表明，驯化获得的MDCKSUS细胞的外泌体蛋白表达发生了显著变化，这些蛋白质表达的变化如何影响MDCK细胞的外泌体功能需要进一步研究；在“分子功能”组中，发现许多差异蛋白质与细胞催化和粘附功能相关，这暗示驯化获得的MDCKSUS细胞除了粘附功能被抑制以外还有许多蛋白酶的表达也发生了变化。图2.2MDCKADH和MDCKSUS细胞显著性差异蛋白质的GO富集分析根据生物学过程（蓝色），细胞成分（红色）和分子功能（黄色）将显著性差异蛋白质划分为不同类别，图中显示的是各类别差异最显著的前十个Fig.2.2AnalysisofGOenrichmentofsignificantlydifferentproteinsinMDCKADHandMDCKSUScellsProteinswithsignificantdifferencesaredividedintocategoriesbasedonbiologicalprocesses(blue),cellularcomposition(red)andmolecularfunction(yellow).Thechartshowsthetoptenmostsignificantdifferencesbycategory3.3粘附相关蛋白的筛选对MDCK细胞上可能发挥粘附功能的蛋白质进行筛眩首先使用GO富集分析，鉴定出了50种蛋白质，它们与细胞粘附功能相关且在MDCKADH和MDCKSUS细胞上的蛋白表达量存在显著性差异。其次筛选了位于细胞膜上或与细胞膜蛋白相结合的蛋白质。最后由于正调控粘附功能的粘附分子在MDCKSUS细胞中表达量必定显著降低，因此筛选了在MDCKADH细胞中表达量高，在MDCKSUS细胞中表达量低的蛋白质。同时符合上述三个标准的蛋白质共有12个（如表2.2）。其中，钙粘附蛋白1（CDH1），桥粒芯蛋白3（DSG3）和上皮细胞粘附分子（EPCAM）已报道在其它细胞中起到典型的细胞粘附分子（CAM）
本文编号：3379969
【文章来源】：西北民族大学甘肃省
【文章页数】：64 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
甲型，乙型，丙型流感病毒结构示意图[42]
19图2.1MDCKADH和MDCKSUS细胞差异蛋白的火山分析图和聚类分析图A.火山图代表MDCKADH与MDCKSUS细胞统计分析中蛋白质水平的差异显著性和差异倍数，绿点是差异显著的蛋白质B.热图代表MDCKADH与MDCKSUS细胞统计学分析中差异显著的蛋白质，以MDCKADH细胞为对照，MDCKSUS细胞蛋白质表达差异倍数以颜色区分，蓝色代表表达量下调的蛋白，红色代表表达量上调的蛋白Fig.2.1MDCKADHandMDCKSUScellsdifferentialproteinvolcanoanalysisdiagramandclusteranalysisdiagramA.ThevolcanographrepresentsthedifferenceandmultipleoftheproteinlevelinthestatisticalanalysisofMDCKADHandMDCKSUScells.ThegreendotistheproteinwithsignificantdifferenceB.HeatmaprepresentsproteinswithsignificantdifferencesinthestatisticalanalysisofMDCKADHandMDCKSUScells.MDCKADHcellsisacontrol.ThedifferenceinMDCKSUScellsproteinexpressioniscolor-coded.Bluerepresentsproteinswithdown-regulatedexpressionandredrepresentsproteinswithup-regulatedexpression3.2GeneOntology（GO）富集分析GeneOntology（GO）是一个拥有持续更新的标准化词汇表来对基因功能进行标准化分类的系统，该系统从三个方面对生物体中的基因及其产物的属性进行描述：分子功能（MolecularFunction）、细胞组分（CellularComponent）和生物过程（BiologicalProcess）。通过Fisher精确检验来评价GO注释的显著性富集分析，本实验GO富集分析中，总共有1250个GO注释，检测了643个差异表达的蛋白质。每组中排名靠前的10个GO注释，由它们之间的差异P值确定（如图2.2）。以MDCKADH细胞为对照，通过驯化获得的MDCKSUS细胞在“生物过程”组中，鉴定出的许多蛋白质都参与细胞代谢的过程，分析表明?
20理过程[149,150]，分析表明，驯化获得的MDCKSUS细胞的外泌体蛋白表达发生了显著变化，这些蛋白质表达的变化如何影响MDCK细胞的外泌体功能需要进一步研究；在“分子功能”组中，发现许多差异蛋白质与细胞催化和粘附功能相关，这暗示驯化获得的MDCKSUS细胞除了粘附功能被抑制以外还有许多蛋白酶的表达也发生了变化。图2.2MDCKADH和MDCKSUS细胞显著性差异蛋白质的GO富集分析根据生物学过程（蓝色），细胞成分（红色）和分子功能（黄色）将显著性差异蛋白质划分为不同类别，图中显示的是各类别差异最显著的前十个Fig.2.2AnalysisofGOenrichmentofsignificantlydifferentproteinsinMDCKADHandMDCKSUScellsProteinswithsignificantdifferencesaredividedintocategoriesbasedonbiologicalprocesses(blue),cellularcomposition(red)andmolecularfunction(yellow).Thechartshowsthetoptenmostsignificantdifferencesbycategory3.3粘附相关蛋白的筛选对MDCK细胞上可能发挥粘附功能的蛋白质进行筛眩首先使用GO富集分析，鉴定出了50种蛋白质，它们与细胞粘附功能相关且在MDCKADH和MDCKSUS细胞上的蛋白表达量存在显著性差异。其次筛选了位于细胞膜上或与细胞膜蛋白相结合的蛋白质。最后由于正调控粘附功能的粘附分子在MDCKSUS细胞中表达量必定显著降低，因此筛选了在MDCKADH细胞中表达量高，在MDCKSUS细胞中表达量低的蛋白质。同时符合上述三个标准的蛋白质共有12个（如表2.2）。其中，钙粘附蛋白1（CDH1），桥粒芯蛋白3（DSG3）和上皮细胞粘附分子（EPCAM）已报道在其它细胞中起到典型的细胞粘附分子（CAM）
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