一株猪传染性胃肠炎病毒的分离鉴定及其对仔猪致病性研究
发布时间：2021-09-05 06:05
猪传染性胃肠炎（Transmissible gastroenteritis,TGE）是由猪传染性胃肠炎病毒（Transmissible gastroenteritis virus,TGEV）引起猪以腹泻、呕吐、脱水为主要特征的一种高度接触性肠道传染病,可感染各个年龄段猪尤其对哺乳仔猪具有高度致死率,传播方式主要是粪-口途径,对养猪业造成很大危害。因此,分离TGEV可为该病的流行病学、生物学特征以及作为疫苗生产的后备毒株筛选奠定物质基础。本研究利用TGEV阳性猪粪便及小肠内容物在PK-15细胞中进行病毒分离,成功分离一株TGEV。该分离毒在盲传10代时出现细胞病变,通过对第15代分离毒进行巢式RT-PCR,间接免疫荧光试验,电镜观察的方法成功鉴定。测定病毒TCID50为10-5.25/0.1 mL。为了深入探究该毒株对仔猪的致病性,本试验对第15代分离毒经口服的方式感染未吃母乳的3日龄仔猪进行致病性分析。结果表明,攻毒组仔猪在感染12 h后陆续出现腹泻症状;而对照组仔猪未见异常。临床症状评分表明攻毒组仔猪在攻毒36 h与阴性对照组相比差异极显著...
【文章来源】：黑龙江八一农垦大学黑龙江省
【文章页数】：47 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
TGEV基因组结构图
一株猪传染性胃肠炎病毒的分离鉴定及其对仔猪致病性研究12沉淀用适量pH7.0溶液悬浮，磷钨酸负染电镜观察结果。2.2.6病毒TCID50计算取96孔细胞培养板，使细胞长满单层进行病毒接种。取编号十个1.5mL离心管，向每支离心管中加入900μL细胞培养液（100%DMEM基础培养液，不含有胎牛血清），然后向1号离心管中加入100μL病毒液，将上述病毒液10倍倍比稀释后接种于96孔细胞培养板，每一稀释度接种一纵排，共8孔，每孔100μL。在每孔加入细胞悬液100μL，同时设正常细胞对照，正常细胞对照作两纵排。（100μL生长液100μL细胞悬液）。将培养板放置于37℃CO2培养箱中培养，每天定时观察并记录出现CPE的细胞孔数，在5%CO2条件下连续培养3~5d。根据Reed-Muench法计算第15代病毒的TCID50[95]。2.3试验结果2.3.1样品巢式RT-PCR鉴定结果为了明确分离样本是TGEV阳性，将实验室保存的腹泻样品剪碎研磨处理，经过RNA提取和反转录后，进行巢式RT-PCR鉴定，结果显示，出现了与预期长度相符的目的片段。图2-1腹泻样品TGEVN基因巢式RT-PCR扩增结果Fig2-1TheinducedforTGEVpartialNgenebynestRT-PCRM.DL2000DNAMarker；1，2.外套扩增产物；3，4.内套扩增产物；5.阴性对照LaneM.DL2000DNAmarker;Lane1,2.Firstroundpositiveamplificationproducts;Lane3,4.Secondroundpositiveamplificationproducts;Lane5.Negativecontrol2.3.2分离毒CPE观察将处理后的TGEV阳性病料接种于PK-15细胞培养60h，将细胞冻融三次继续接种于PK-15细胞直至出现细胞病变。结果显示在盲传第10代60h首次出现CPE，但CPE不明显，随着代次增加CPE出现的时间缩短，当盲传到第15代48h时，可观察到PK-15细胞出现明显的细胞病变。主要表现为细胞圆缩并形成合胞体，部分细胞有脱落现象，其细胞
猪传染性胃肠炎病毒的分离鉴定13病变形态为典型的TGEV感染细胞病变；而未接毒的细胞无细胞病变现象且细胞状态良好。图2-2TGEV分离株感染PK-15细胞48hCPE观察Fig2-2Cytopathogeniceffect(CPE)inducedbyTGEVonPK-15cell48hA：未接毒的PK-15细胞；B:TGEV分离毒感染的PK-15细胞A：PK-15cellwithoutinoculatedbyTGEV.B：TheCPEofPK-15cellinducedbyTGEV2.3.3分离毒RT-PCR特异性检测结果为了从核酸角度验证分离毒是TGEV，将第15代分离毒通过巢式RT-PCR鉴定，并用实验室已建立的方法与PEDV、PDCoV进行共同检测。结果显示，分离毒泳道出现的片段与预期大小相符。其他猪肠道病毒均为阴性。说明只有TGEV在PK-15细胞中得到了增殖。图2-3TGEV分离毒病原特异性RT-PCR鉴定结果Fig2-3RT-PCRspecificityidentificationofTGEVisolationstrainM.DL2000DNAMarker；1.TGEV检测；2.阴性对照；3.PEDV检测；4.PDCoV检测LaneM.DL2000DNAmarker;Lane1.TGEVdetection;Lane2.Negativecontrol;Lane3.PEDVdetection；4.PEDVdetection2.3.4分离毒IFA鉴定结果通过IFA试验鉴定分离毒是TGEV，选择第15代分离毒进行验证。利用TGEVN蛋白鼠源单克隆抗体作为一抗，正常培养的PK-15细胞为阴性对照。结果显示，接毒组出现明显绿色荧光信号，而对照组未见荧光信号。
【参考文献】：
期刊论文
[1]2018年广西重要猪源病毒性疫病流行病学调查[J]. 施开创,尹彦文,王孝德,谢守玉,石永胜,刘宏梅,陆文俊,屈素洁,冯淑萍,粟艳琼. 中国畜牧兽医. 2020(01)
[2]猪传染性胃肠炎病毒SY株的分离鉴定及S基因的序列分析[J]. 尤刘阳,苏丹萍,宋亚兵,王飞,陈小芬,贺东生. 中国兽医科学. 2016(05)
[3]猪腹泻相关病毒多重RT-PCR检测方法的建立[J]. 吴洋,杜彩虹,张博,唐丽杰,乔薪瑗,姜艳平,李一经. 中国预防兽医学报. 2014(05)
[4]猪传染性胃肠炎病毒江苏株的分离与鉴定及其S基因序列分析[J]. 郭容利,倪艳秀,温立斌,李彬,王小敏,俞正玉,何孔旺. 华北农学报. 2013(05)
[5]猪传染性胃肠炎病毒LJ-12株的分离与鉴定[J]. 姜春霞,马广鹏,姜艳平,崔文,李海滨,唐丽杰,葛俊伟,乔薪瑗,李一经. 畜牧与兽医. 2013(03)
[6]猪传染性胃肠炎病毒福建株M基因的克隆与生物信息学分析[J]. 朱晓琳,王劭,陈少莺,林锋强,程晓霞,陈仕龙,朱小丽,李兆龙. 福建农业学报. 2011(06)
[7]猪流行性腹泻病毒N基因的克隆及原核表达[J]. 杨巍,李广兴,孟凡丹,王鑫,任晓峰. 东北农业大学学报. 2011(06)
[8]套式PCR与血清学方法用于检测肺炎支原体感染的对比研究[J]. 刘雪梅,唐正宇,谢良依. 当代医学. 2011(18)
[9]一例猪传染性胃肠炎的诊断及预防[J]. 张蕾. 湖南畜牧兽医. 2010(06)
[10]猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒和猪A群轮状病毒多重RT-PCR检测方法的建立及临床应用[J]. 张坤,何启盖. 畜牧兽医学报. 2010(08)
博士论文
[1]猪流行性腹泻病毒感染性cDNA克隆的构建及S基因突变对弱毒株体外增殖和致病性的影响[D]. 李劼.中国农业大学 2017
[2]猪传染性胃肠炎病毒感染ST细胞差异蛋白质组学研究[D]. 马瑞丽.西北农林科技大学 2015
[3]猪传染性胃肠炎病毒强弱毒株与猪空肠上皮细胞和猪树突状细胞相互作用的研究[D]. 赵珊珊.南京农业大学 2014
硕士论文
[1]猪传染性胃肠炎流行毒株的分离鉴定及全基因组分析[D]. 朱蕴暖.黑龙江八一农垦大学 2017
[2]猪传染性胃肠炎病毒分离及部分特性鉴定[D]. 徐静.东北农业大学 2015
[3]传染性胰腺坏死病毒VP2抗原表位区间接免疫荧光方法的建立[D]. 王健楠.东北农业大学 2012
[4]猪传染性胃肠炎病毒TaqMan荧光定量RT-PCR方法的建立及初步应用[D]. 肖文.华中农业大学 2011
[5]猪传染性胃肠炎和流行性腹泻二联核酸疫苗免疫效力研究[D]. 孟凡丹.东北农业大学 2011
[6]猪细小病毒VP2蛋白单克隆抗体的制备及双抗体夹心ELISA方法的初步建立[D]. 刘秀芬.东北农业大学 2009
[7]猪传染性胃肠炎病毒SC-H株重组N蛋白单克隆抗体的制备[D]. 李娜.四川农业大学 2008
[8]猪传染性胃肠炎和流行性腹泻病毒的分离、鉴定及部分基因序列分析[D]. 刘矿.河南农业大学 2008
[9]猪传染性胃肠炎病毒胶体金免疫层析试纸条的研制[D]. 畅丹.东北农业大学 2008
本文编号：3384825
【文章来源】：黑龙江八一农垦大学黑龙江省
【文章页数】：47 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
TGEV基因组结构图
一株猪传染性胃肠炎病毒的分离鉴定及其对仔猪致病性研究12沉淀用适量pH7.0溶液悬浮，磷钨酸负染电镜观察结果。2.2.6病毒TCID50计算取96孔细胞培养板，使细胞长满单层进行病毒接种。取编号十个1.5mL离心管，向每支离心管中加入900μL细胞培养液（100%DMEM基础培养液，不含有胎牛血清），然后向1号离心管中加入100μL病毒液，将上述病毒液10倍倍比稀释后接种于96孔细胞培养板，每一稀释度接种一纵排，共8孔，每孔100μL。在每孔加入细胞悬液100μL，同时设正常细胞对照，正常细胞对照作两纵排。（100μL生长液100μL细胞悬液）。将培养板放置于37℃CO2培养箱中培养，每天定时观察并记录出现CPE的细胞孔数，在5%CO2条件下连续培养3~5d。根据Reed-Muench法计算第15代病毒的TCID50[95]。2.3试验结果2.3.1样品巢式RT-PCR鉴定结果为了明确分离样本是TGEV阳性，将实验室保存的腹泻样品剪碎研磨处理，经过RNA提取和反转录后，进行巢式RT-PCR鉴定，结果显示，出现了与预期长度相符的目的片段。图2-1腹泻样品TGEVN基因巢式RT-PCR扩增结果Fig2-1TheinducedforTGEVpartialNgenebynestRT-PCRM.DL2000DNAMarker；1，2.外套扩增产物；3，4.内套扩增产物；5.阴性对照LaneM.DL2000DNAmarker;Lane1,2.Firstroundpositiveamplificationproducts;Lane3,4.Secondroundpositiveamplificationproducts;Lane5.Negativecontrol2.3.2分离毒CPE观察将处理后的TGEV阳性病料接种于PK-15细胞培养60h，将细胞冻融三次继续接种于PK-15细胞直至出现细胞病变。结果显示在盲传第10代60h首次出现CPE，但CPE不明显，随着代次增加CPE出现的时间缩短，当盲传到第15代48h时，可观察到PK-15细胞出现明显的细胞病变。主要表现为细胞圆缩并形成合胞体，部分细胞有脱落现象，其细胞
猪传染性胃肠炎病毒的分离鉴定13病变形态为典型的TGEV感染细胞病变；而未接毒的细胞无细胞病变现象且细胞状态良好。图2-2TGEV分离株感染PK-15细胞48hCPE观察Fig2-2Cytopathogeniceffect(CPE)inducedbyTGEVonPK-15cell48hA：未接毒的PK-15细胞；B:TGEV分离毒感染的PK-15细胞A：PK-15cellwithoutinoculatedbyTGEV.B：TheCPEofPK-15cellinducedbyTGEV2.3.3分离毒RT-PCR特异性检测结果为了从核酸角度验证分离毒是TGEV，将第15代分离毒通过巢式RT-PCR鉴定，并用实验室已建立的方法与PEDV、PDCoV进行共同检测。结果显示，分离毒泳道出现的片段与预期大小相符。其他猪肠道病毒均为阴性。说明只有TGEV在PK-15细胞中得到了增殖。图2-3TGEV分离毒病原特异性RT-PCR鉴定结果Fig2-3RT-PCRspecificityidentificationofTGEVisolationstrainM.DL2000DNAMarker；1.TGEV检测；2.阴性对照；3.PEDV检测；4.PDCoV检测LaneM.DL2000DNAmarker;Lane1.TGEVdetection;Lane2.Negativecontrol;Lane3.PEDVdetection；4.PEDVdetection2.3.4分离毒IFA鉴定结果通过IFA试验鉴定分离毒是TGEV，选择第15代分离毒进行验证。利用TGEVN蛋白鼠源单克隆抗体作为一抗，正常培养的PK-15细胞为阴性对照。结果显示，接毒组出现明显绿色荧光信号，而对照组未见荧光信号。
【参考文献】：
期刊论文
[1]2018年广西重要猪源病毒性疫病流行病学调查[J]. 施开创,尹彦文,王孝德,谢守玉,石永胜,刘宏梅,陆文俊,屈素洁,冯淑萍,粟艳琼. 中国畜牧兽医. 2020(01)
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[3]猪腹泻相关病毒多重RT-PCR检测方法的建立[J]. 吴洋,杜彩虹,张博,唐丽杰,乔薪瑗,姜艳平,李一经. 中国预防兽医学报. 2014(05)
[4]猪传染性胃肠炎病毒江苏株的分离与鉴定及其S基因序列分析[J]. 郭容利,倪艳秀,温立斌,李彬,王小敏,俞正玉,何孔旺. 华北农学报. 2013(05)
[5]猪传染性胃肠炎病毒LJ-12株的分离与鉴定[J]. 姜春霞,马广鹏,姜艳平,崔文,李海滨,唐丽杰,葛俊伟,乔薪瑗,李一经. 畜牧与兽医. 2013(03)
[6]猪传染性胃肠炎病毒福建株M基因的克隆与生物信息学分析[J]. 朱晓琳,王劭,陈少莺,林锋强,程晓霞,陈仕龙,朱小丽,李兆龙. 福建农业学报. 2011(06)
[7]猪流行性腹泻病毒N基因的克隆及原核表达[J]. 杨巍,李广兴,孟凡丹,王鑫,任晓峰. 东北农业大学学报. 2011(06)
[8]套式PCR与血清学方法用于检测肺炎支原体感染的对比研究[J]. 刘雪梅,唐正宇,谢良依. 当代医学. 2011(18)
[9]一例猪传染性胃肠炎的诊断及预防[J]. 张蕾. 湖南畜牧兽医. 2010(06)
[10]猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒和猪A群轮状病毒多重RT-PCR检测方法的建立及临床应用[J]. 张坤,何启盖. 畜牧兽医学报. 2010(08)
博士论文
[1]猪流行性腹泻病毒感染性cDNA克隆的构建及S基因突变对弱毒株体外增殖和致病性的影响[D]. 李劼.中国农业大学 2017
[2]猪传染性胃肠炎病毒感染ST细胞差异蛋白质组学研究[D]. 马瑞丽.西北农林科技大学 2015
[3]猪传染性胃肠炎病毒强弱毒株与猪空肠上皮细胞和猪树突状细胞相互作用的研究[D]. 赵珊珊.南京农业大学 2014
硕士论文
[1]猪传染性胃肠炎流行毒株的分离鉴定及全基因组分析[D]. 朱蕴暖.黑龙江八一农垦大学 2017
[2]猪传染性胃肠炎病毒分离及部分特性鉴定[D]. 徐静.东北农业大学 2015
[3]传染性胰腺坏死病毒VP2抗原表位区间接免疫荧光方法的建立[D]. 王健楠.东北农业大学 2012
[4]猪传染性胃肠炎病毒TaqMan荧光定量RT-PCR方法的建立及初步应用[D]. 肖文.华中农业大学 2011
[5]猪传染性胃肠炎和流行性腹泻二联核酸疫苗免疫效力研究[D]. 孟凡丹.东北农业大学 2011
[6]猪细小病毒VP2蛋白单克隆抗体的制备及双抗体夹心ELISA方法的初步建立[D]. 刘秀芬.东北农业大学 2009
[7]猪传染性胃肠炎病毒SC-H株重组N蛋白单克隆抗体的制备[D]. 李娜.四川农业大学 2008
[8]猪传染性胃肠炎和流行性腹泻病毒的分离、鉴定及部分基因序列分析[D]. 刘矿.河南农业大学 2008
[9]猪传染性胃肠炎病毒胶体金免疫层析试纸条的研制[D]. 畅丹.东北农业大学 2008
本文编号：3384825
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