水稻瘤矮病毒侵染介体昆虫细胞诱导形成病毒原质的机制
发布时间：2022-01-03 10:25
水稻瘤矮病毒（Rice gall dwarf virus, RGDV）是呼肠孤病毒科（Reoviridae）植物呼肠孤病毒属（Phytoreovirus）的一个成员,在寄主植物和介体昆虫细胞内都能进行有效的增殖,由介体电光叶蝉和黑尾叶蝉以持久增殖型方式传播。其基因组编码6个结构蛋白（P1、P2、P3、P5、P6和P8）和6个非结构蛋白（Pns4、 Pns7、Pns、Pns10、Pns11和Pns12）。本文利用草地贪夜蛾细胞（Spodoptera frugiperda, Sf9）和电光叶蝉培养细胞体系,对非结构蛋白Pns7、Pns9、Pns12及结构蛋白P8进行了功能研究。为了明确RGDV的病毒原质形成机制,本研究通过异源表达体系分析Pns7、Pns9和Pns12在Sf9细胞内的定位情况。结果发现Pns7和Pns9定位在细胞质中,而Pns12定位在细胞质和细胞核内。将三个非结构蛋白分别进行两两共定位,发现Pns7和Pns9能够共定位在细胞质中,而Pns7和Pnsl2未出现共同定位在细胞内的情况,仍与单独表达的情况相似；当Pns9和Pns12共表达时,发现Pns9可以招募定位于细胞核的P...
【文章来源】：福建农林大学福建省
【文章页数】：62 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
摘要
Abstract
1. 前言
1.1 水稻瘤矮病毒的研究概况
1.1.1 水稻瘤矮病
1.1.2 水稻瘤矮病毒粒体结构和特点
1.1.3 RGDV基因组及蛋白功能的研究
1.1.4 RGDV的传播介体
1.2 植物呼肠孤病毒在介体内复制和装配的研究
1.3 昆虫细胞培养及其应用
1.3.1 昆虫细胞培养
1.3.2 昆虫细胞培养的应用
1.4 Bac-to-Bac杆状病毒表达系统
1.4.1 Bac-to-Bac杆状病毒表达系统的原理
1.4.2 Bac-to-Bac杆状病毒表达系统的应用
1.5 RNAi原理及其应用
1.5.1 RNAi原理
1.5.2 RNAi的应用
1.6 本研究的目的和意义
2. RGDV非结构蛋白Pns7、Pns9、Pns12的功能研究
2.1 材料
2.1.1 RGDV毒株和电光叶蝉
2.1.2 菌株、培养细胞和载体
2.1.3 实验试剂、药品和实验仪器
2.2 方法
2.2.1 Bacmid DNA重组穿梭质粒表达载体的构建
2.2.1.1 水稻病叶总RNA的提取
2.2.1.2 RGDVIns7、Pns9和Pns12基因的扩增
2.2.1.3 RGDVPns7、Pns9和Pns12目的基因DNA片段的回收
2.2.1.4 RGDVPns7、Pns9和Pns12目的基因连接pMD18-T克隆载体
2.2.1.5 目的基因转化大肠杆菌DH5α感受态细胞
2.2.1.6 质粒的提取与阳性克隆鉴定
2.2.1.7 质粒的双酶切鉴定
2.2.1.8 目的基因与表达载体pFastBacl的连接
2.2.1.9 重组质粒转化大肠杆菌DH10Bac
2.2.1.10 Bacmid DNA重组穿梭质粒的提取
2.2.1.11 Bacmid DNA重组穿梭质粒的PCR检测
2.2.2 Bacmid DNA重组穿梭质粒转染Sf9细胞
2.2.2.1 Sf9培养细胞的准备
2.2.2.2 Sf9培养细胞侵染上清液的制备
2.2.2.3 免疫荧光标记法检测Pns7、Pns9和Pns12的表达
2.2.3 双链的合成
2.2.4 免疫荧光标记检测dsPns7、dsPns9、dsPns12对RGDV侵染的影响
2.3 结果与分析
2.3.1 RGDV Pns7、Pns9和Pns12基因片段的扩增
2.3.2 重组质粒的双酶切鉴定
2.3.3 RDGV Pns7、Pns9和Pns12在Sf9细胞中的表达
2.3.4 RGDV Pns7、Pns9和Pns12片段dsRNAs的合成
2.3.5 dsRNAs对RGDV在电光叶蝉培养细胞内复制的影响
2.4 讨论
3. RGDV外壳蛋白P8的功能研究
3.1 材料
3.2 方法
3.2.1 目的基因片段dsRNAs的合成
3.2.2 电光叶蝉培养细胞VCMs的培养
3.2.3 病毒侵染液的制备
3.2.4 免疫荧光标记检测dsP8对RGDV侵染的影响
3.2.5 病毒基因组dsRNAs的提取与检测
3.2.6 Western blot检测dsRNA处理细胞对病毒编码蛋白的影响
3.3 结果与分析
3.3.1 P8和GFP片段dsRNAs的合成
3.3.2 dsRNAs对RGDV在介体培养细胞内装配的影响
3.3.3 dsP8对病毒基因组复制的影响
3.3.4 dsP8对RGDV蛋白表达的影响
3.4 讨论
4. 小结
参考文献
附录1 所用主要试剂及缓冲液的配置
附录2 载体图谱
致谢
【参考文献】：
期刊论文
[1]重组人凝血因子Ⅷ在昆虫表达系统的分泌表达及鉴定[J]. 孙夏瑜,李杰,武坚锐,周岩,郭跃贞. 中国优生与遗传杂志. 2014(07)
[2]苹果蠹蛾颗粒体病毒（CpGV）GP37蛋白在Bac-to-Bac系统中的表达和亚细胞定位[J]. 刘向阳,孙修炼,张忠信,周琳. 农业生物技术学报. 2014(05)
[3]昆虫杆状病毒系统表达登革2型病毒prM/E蛋白[J]. 刘晓宇,姚立红,陈爱珺,郭建强,张智清,陈辉. 中国医学装备. 2014(05)
[4]Trizol试剂法快速高效提取3种作物不同组织总RNA[J]. 吴凯朝,黄诚梅,李杨瑞,杨丽涛,吴建明. 南方农业学报. 2012(12)
[5]利用昆虫-杆状病毒表达系统表达人乳头瘤病毒16/18/33/58亚型L1蛋白[J]. 江为,靳彦文,刘萱,曹诚. 生物技术通讯. 2012(04)
[6]利用Bac-to-Bac杆状病毒表达系统在家蚕中表达人生长素[J]. 付凡,陈蔚,唐顺明,汪生鹏,黄金山,赵巧玲,沈兴家. 蚕业科学. 2011(02)
[7]水稻瘤矮病毒S12编码第2个RNA沉默抑制子[J]. 吴建国,王春政,杜振国,蔡丽君,胡梅群,吴祖建,李毅,谢联辉. 中国科学:生命科学. 2011(01)
[8]昆虫细胞培养及应用[J]. 闫玉涛,贺莉芳,刘晖,李晓飞,刘流,晏容,姚奎. 医学动物防制. 2010(08)
[9]水稻瘤矮病毒基因组第11片段编码一个RNA沉默抑制子[J]. 刘福秀,赵芹,阮小蕾,何云蔚,李华平. 科学通报. 2008(01)
[10]昆虫细胞系的培养和建立技术[J]. 张寰,张永安,秦启联,王玉珠,曲良建,李瑄,苗麟,殷珍仙,张爱君,温发园. 昆虫学报. 2007(08)
博士论文
[1]水稻瘤矮病毒病毒样颗粒组装及Pns12蛋白的亚细胞定位[D]. 范国成.福建农林大学 2008
本文编号：3566108
【文章来源】：福建农林大学福建省
【文章页数】：62 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
摘要
Abstract
1. 前言
1.1 水稻瘤矮病毒的研究概况
1.1.1 水稻瘤矮病
1.1.2 水稻瘤矮病毒粒体结构和特点
1.1.3 RGDV基因组及蛋白功能的研究
1.1.4 RGDV的传播介体
1.2 植物呼肠孤病毒在介体内复制和装配的研究
1.3 昆虫细胞培养及其应用
1.3.1 昆虫细胞培养
1.3.2 昆虫细胞培养的应用
1.4 Bac-to-Bac杆状病毒表达系统
1.4.1 Bac-to-Bac杆状病毒表达系统的原理
1.4.2 Bac-to-Bac杆状病毒表达系统的应用
1.5 RNAi原理及其应用
1.5.1 RNAi原理
1.5.2 RNAi的应用
1.6 本研究的目的和意义
2. RGDV非结构蛋白Pns7、Pns9、Pns12的功能研究
2.1 材料
2.1.1 RGDV毒株和电光叶蝉
2.1.2 菌株、培养细胞和载体
2.1.3 实验试剂、药品和实验仪器
2.2 方法
2.2.1 Bacmid DNA重组穿梭质粒表达载体的构建
2.2.1.1 水稻病叶总RNA的提取
2.2.1.2 RGDVIns7、Pns9和Pns12基因的扩增
2.2.1.3 RGDVPns7、Pns9和Pns12目的基因DNA片段的回收
2.2.1.4 RGDVPns7、Pns9和Pns12目的基因连接pMD18-T克隆载体
2.2.1.5 目的基因转化大肠杆菌DH5α感受态细胞
2.2.1.6 质粒的提取与阳性克隆鉴定
2.2.1.7 质粒的双酶切鉴定
2.2.1.8 目的基因与表达载体pFastBacl的连接
2.2.1.9 重组质粒转化大肠杆菌DH10Bac
2.2.1.10 Bacmid DNA重组穿梭质粒的提取
2.2.1.11 Bacmid DNA重组穿梭质粒的PCR检测
2.2.2 Bacmid DNA重组穿梭质粒转染Sf9细胞
2.2.2.1 Sf9培养细胞的准备
2.2.2.2 Sf9培养细胞侵染上清液的制备
2.2.2.3 免疫荧光标记法检测Pns7、Pns9和Pns12的表达
2.2.3 双链的合成
2.2.4 免疫荧光标记检测dsPns7、dsPns9、dsPns12对RGDV侵染的影响
2.3 结果与分析
2.3.1 RGDV Pns7、Pns9和Pns12基因片段的扩增
2.3.2 重组质粒的双酶切鉴定
2.3.3 RDGV Pns7、Pns9和Pns12在Sf9细胞中的表达
2.3.4 RGDV Pns7、Pns9和Pns12片段dsRNAs的合成
2.3.5 dsRNAs对RGDV在电光叶蝉培养细胞内复制的影响
2.4 讨论
3. RGDV外壳蛋白P8的功能研究
3.1 材料
3.2 方法
3.2.1 目的基因片段dsRNAs的合成
3.2.2 电光叶蝉培养细胞VCMs的培养
3.2.3 病毒侵染液的制备
3.2.4 免疫荧光标记检测dsP8对RGDV侵染的影响
3.2.5 病毒基因组dsRNAs的提取与检测
3.2.6 Western blot检测dsRNA处理细胞对病毒编码蛋白的影响
3.3 结果与分析
3.3.1 P8和GFP片段dsRNAs的合成
3.3.2 dsRNAs对RGDV在介体培养细胞内装配的影响
3.3.3 dsP8对病毒基因组复制的影响
3.3.4 dsP8对RGDV蛋白表达的影响
3.4 讨论
4. 小结
参考文献
附录1 所用主要试剂及缓冲液的配置
附录2 载体图谱
致谢
【参考文献】：
期刊论文
[1]重组人凝血因子Ⅷ在昆虫表达系统的分泌表达及鉴定[J]. 孙夏瑜,李杰,武坚锐,周岩,郭跃贞. 中国优生与遗传杂志. 2014(07)
[2]苹果蠹蛾颗粒体病毒（CpGV）GP37蛋白在Bac-to-Bac系统中的表达和亚细胞定位[J]. 刘向阳,孙修炼,张忠信,周琳. 农业生物技术学报. 2014(05)
[3]昆虫杆状病毒系统表达登革2型病毒prM/E蛋白[J]. 刘晓宇,姚立红,陈爱珺,郭建强,张智清,陈辉. 中国医学装备. 2014(05)
[4]Trizol试剂法快速高效提取3种作物不同组织总RNA[J]. 吴凯朝,黄诚梅,李杨瑞,杨丽涛,吴建明. 南方农业学报. 2012(12)
[5]利用昆虫-杆状病毒表达系统表达人乳头瘤病毒16/18/33/58亚型L1蛋白[J]. 江为,靳彦文,刘萱,曹诚. 生物技术通讯. 2012(04)
[6]利用Bac-to-Bac杆状病毒表达系统在家蚕中表达人生长素[J]. 付凡,陈蔚,唐顺明,汪生鹏,黄金山,赵巧玲,沈兴家. 蚕业科学. 2011(02)
[7]水稻瘤矮病毒S12编码第2个RNA沉默抑制子[J]. 吴建国,王春政,杜振国,蔡丽君,胡梅群,吴祖建,李毅,谢联辉. 中国科学:生命科学. 2011(01)
[8]昆虫细胞培养及应用[J]. 闫玉涛,贺莉芳,刘晖,李晓飞,刘流,晏容,姚奎. 医学动物防制. 2010(08)
[9]水稻瘤矮病毒基因组第11片段编码一个RNA沉默抑制子[J]. 刘福秀,赵芹,阮小蕾,何云蔚,李华平. 科学通报. 2008(01)
[10]昆虫细胞系的培养和建立技术[J]. 张寰,张永安,秦启联,王玉珠,曲良建,李瑄,苗麟,殷珍仙,张爱君,温发园. 昆虫学报. 2007(08)
博士论文
[1]水稻瘤矮病毒病毒样颗粒组装及Pns12蛋白的亚细胞定位[D]. 范国成.福建农林大学 2008
本文编号：3566108
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