circAgtpbp1通过竞争性结合miR-543-5p调控大鼠腺垂体GH分泌机制的研究
发布时间：2022-02-05 01:49
生长激素（growthhormone,GH）是在腺垂体中合成的一种蛋白质类激素,几乎能作用于所有的组织,调节细胞的代谢并具有脂解作用。当生长激素分泌过多时,会引起巨人症和肢端肥大症;当生长激素分泌过少时,将导致侏儒症。所以将GH保持在稳定且合适的水平以维持生理稳态具有十分重要的意义。GH的生成主要受生长激素释放激素（growth hormone regulating hormone,GHRH）和生长激素释放抑制激素（growth hormone release-inlease-inhibiting hormone,GHRIH）这两种激素调控。除了这两个经典的调节因子外,各种神经递质、激素或细胞因子在GH分泌中也起作用。因此,明确参与GH调节的分子机制至关重要。circular RNA（circRNA）是一类内源性长链非编码RNA,目前已有大量研究证明circRNA在不同的物种和细胞系中具有不同生物学功能,其中被研究最多的是circRNA具有ceRNA的功能,可以通过miRNA反应原件（MRE）与大量miRNA相结合并影响miRNA对其靶基因的结合能力,进而负性调节该miRNA的生物学功...
【文章来源】：吉林大学吉林省211工程院校985工程院校教育部直属院校
【文章页数】：85 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
图２．３?ｃｅＲＮＡ网络―??Ｆｉｇ．２．３?ｃｅＲＮＡ?ｎｅｔｗｏｒｋ１１？??２．２．３．２与ＲＮＡ结合蛋白相互作用??ｃｉｒｃＲＮＡ还可以通过与ＲＮＡ结合蛋白相互作用在转录后水平调控基因表达??
第工篇研＿究内容：第一章?ｍｉＲ－５４＿３－５ｐ的差异表达在大＿鼠腺垂体细Ｊｆｅ中对ＧＨ的调控作用??序列片段克隆至载体中，载体图谱如图１．１：??Ｊｒ?ｐｍｉＲ－ＲＢ－ＲＥＰＯＲＴ＊?＼??ｈｓｖ－ｔｋ?ｖｅｃｔｏｒ?丄??ｐｒｏｍｏｔｅｒ?＿＿＿＿?ｖｃｕｌｕｊ．?■??Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ??７＾ｒ＾＾Ｐ〇＿?ＭｓＶ４０?ｅａｒｌｙ??Ｐｍｅｌ?ｆ＼?＼?ｅｎｈａｎｃｅｒ／??Ｘｈｏｌ?／?＼?＼?ｐｒｏｍｏｔｅｒ??ｓ９ｆｌ?／??图１．１酶切载体示意图??Ｆｉｇｌ．ｌ?Ｓｃｈｅｍａｔｉｃ?ｄｉａｇｒａｍ?ｏｆ?ｅｎｚｙｍｅ?ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ?ｖｅｃｔｏｒ??（２）基因合成：通过全基因合成的方法获得野生型的模板ａ??（３）?酶切：用Ｘｈｏｌ，Ｎｏｔｌ对野生驾的模板以及载体进行双酶切，酶切反??应体系如下：ｌ〇ｘＨ缓冲液４０，ＤＮＡ约２昭，内切酶（ｌＯＵ／ｐｌ）各１此补充灭菌??去离子水使总体系至４００。３７°Ｃ条件下反应４小时。??（４）酶切＿收纯化：在酶切之后０收酶切产物，根据说明书纯化产物。??（５）连接：＿的．片段?ＤＮＡ２（ｉｌ（约?ｌ５〇ｎｇ），载体?０．５［ｉｌ（约?５〇ｎｇ），ｓｏｌｕｔｉｏｎ??Ｉ快速连接液５汕补充灭菌去离子水至总体系为１０?ｐｉ，１６°Ｃ连接３０分钟。??（６）转化：??１、?将连接产物与１０００?ＤＨ５ａ感受态细胞充分混匀后置于冰上孵育??３０ｍｉｎ〇??２、?孵育后将转化液置于４２°Ｃ水浴锅中水浴９０秒，再马上取出，并继续置??于冰上孵育３ｍｉｎ。??２３??
ｐＭ?各?０．５?ｐｉ，?Ｔａｑ?ＤＮＡ?聚合酶??Ｃ２．５Ｕ４ｉｌ）?０．３ｐｌ，ＤＮＡ模板０．５…，补充无菌水至总体系为Ｉ。－。反应条件为??预变性９５°Ｃ?３分钟，循环内９５°Ｃ?３０秒变性，５６°Ｃ退火，７２°Ｃ延伸１分钟；２０??个循环；ＰＣＲ反应循环后７２°Ｃ继续延伸３分钟，然后４°Ｃ保存６??实验挑起了上述平板上的共五处单菌落进行ＰＣＲ，取５ｐｌ?ＰＣＲ产物进行１．５％??琼脂糖电泳分析，根据所设计的引物而扩増的条带片段理论大小应在３００ｂｐ左??右，琼脂糖凝胶电泳图如图１．２：??Ｍ??２５０ｂｐ—＾＿＿３〇〇ｂｐ??ｒ－Ｇｈｌ－ＷＴ??图１．２联合载体扩增后ＰＣＲ??Ｆｉｇ．?１．２?ＰＣＲ?ｏｆ?ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ－ｖｅｃｔｏｒｓ??１．２．８双荧光素酶实验??（１）?３７°Ｃ，５％的Ｃ０２培养箱中培养２９３Ｔ细胞。??２４??
本文编号：3614339
【文章来源】：吉林大学吉林省211工程院校985工程院校教育部直属院校
【文章页数】：85 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
图２．３?ｃｅＲＮＡ网络―??Ｆｉｇ．２．３?ｃｅＲＮＡ?ｎｅｔｗｏｒｋ１１？??２．２．３．２与ＲＮＡ结合蛋白相互作用??ｃｉｒｃＲＮＡ还可以通过与ＲＮＡ结合蛋白相互作用在转录后水平调控基因表达??
第工篇研＿究内容：第一章?ｍｉＲ－５４＿３－５ｐ的差异表达在大＿鼠腺垂体细Ｊｆｅ中对ＧＨ的调控作用??序列片段克隆至载体中，载体图谱如图１．１：??Ｊｒ?ｐｍｉＲ－ＲＢ－ＲＥＰＯＲＴ＊?＼??ｈｓｖ－ｔｋ?ｖｅｃｔｏｒ?丄??ｐｒｏｍｏｔｅｒ?＿＿＿＿?ｖｃｕｌｕｊ．?■??Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ??７＾ｒ＾＾Ｐ〇＿?ＭｓＶ４０?ｅａｒｌｙ??Ｐｍｅｌ?ｆ＼?＼?ｅｎｈａｎｃｅｒ／??Ｘｈｏｌ?／?＼?＼?ｐｒｏｍｏｔｅｒ??ｓ９ｆｌ?／??图１．１酶切载体示意图??Ｆｉｇｌ．ｌ?Ｓｃｈｅｍａｔｉｃ?ｄｉａｇｒａｍ?ｏｆ?ｅｎｚｙｍｅ?ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ?ｖｅｃｔｏｒ??（２）基因合成：通过全基因合成的方法获得野生型的模板ａ??（３）?酶切：用Ｘｈｏｌ，Ｎｏｔｌ对野生驾的模板以及载体进行双酶切，酶切反??应体系如下：ｌ〇ｘＨ缓冲液４０，ＤＮＡ约２昭，内切酶（ｌＯＵ／ｐｌ）各１此补充灭菌??去离子水使总体系至４００。３７°Ｃ条件下反应４小时。??（４）酶切＿收纯化：在酶切之后０收酶切产物，根据说明书纯化产物。??（５）连接：＿的．片段?ＤＮＡ２（ｉｌ（约?ｌ５〇ｎｇ），载体?０．５［ｉｌ（约?５〇ｎｇ），ｓｏｌｕｔｉｏｎ??Ｉ快速连接液５汕补充灭菌去离子水至总体系为１０?ｐｉ，１６°Ｃ连接３０分钟。??（６）转化：??１、?将连接产物与１０００?ＤＨ５ａ感受态细胞充分混匀后置于冰上孵育??３０ｍｉｎ〇??２、?孵育后将转化液置于４２°Ｃ水浴锅中水浴９０秒，再马上取出，并继续置??于冰上孵育３ｍｉｎ。??２３??
ｐＭ?各?０．５?ｐｉ，?Ｔａｑ?ＤＮＡ?聚合酶??Ｃ２．５Ｕ４ｉｌ）?０．３ｐｌ，ＤＮＡ模板０．５…，补充无菌水至总体系为Ｉ。－。反应条件为??预变性９５°Ｃ?３分钟，循环内９５°Ｃ?３０秒变性，５６°Ｃ退火，７２°Ｃ延伸１分钟；２０??个循环；ＰＣＲ反应循环后７２°Ｃ继续延伸３分钟，然后４°Ｃ保存６??实验挑起了上述平板上的共五处单菌落进行ＰＣＲ，取５ｐｌ?ＰＣＲ产物进行１．５％??琼脂糖电泳分析，根据所设计的引物而扩増的条带片段理论大小应在３００ｂｐ左??右，琼脂糖凝胶电泳图如图１．２：??Ｍ??２５０ｂｐ—＾＿＿３〇〇ｂｐ??ｒ－Ｇｈｌ－ＷＴ??图１．２联合载体扩增后ＰＣＲ??Ｆｉｇ．?１．２?ＰＣＲ?ｏｆ?ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ－ｖｅｃｔｏｒｓ??１．２．８双荧光素酶实验??（１）?３７°Ｃ，５％的Ｃ０２培养箱中培养２９３Ｔ细胞。??２４??
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