雄性绵羊SYCE1基因的克
发布时间：2022-08-08 18:18
联会复合中心组分蛋白1（Synaptonemal complex central element protein1,SYCE1）该基因是组成联会复合体（Synaptonemal complex,SC）的主要成员,且对动物生殖发育具有非常重要的影响。雄性动物的生殖系统相对复杂,分泌激素、产生精子和成熟等功能主要由下丘脑-垂体-睾丸轴支撑,其次与各种参与的调节蛋白密切相关。本研究以雄性绵羊为研究对象,通过RT-PCR克隆绵羊SYCE1基因序列并对序列进行分析;利用qRT-PCR、Western blotting、免疫组化等技术分析SYCE1在绵羊下丘脑-垂体-睾丸生殖轴中及不同发育阶段（40日龄、3月龄和12月龄）睾丸中的表达情况;以绵羊睾丸支持细胞为研究对象,通过转染pEGFP-C1-SYCE1载体和siRNA-SYCE1载体进行SYCE1基因的功能验证。结果发现:1、绵羊SYCE1该基因CDS全长972 bp,为非跨膜可溶性不稳定蛋白,编码274个氨基酸残基;SYCE1基因在不同种间进化中高度保守。2、SYCE1在绵羊附睾（头、体、尾）、睾丸、下丘脑和垂体各组织中mRNA和蛋白上均有表...
【文章页数】：68 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
缩略词对照表
中文摘要
SUMMARY
第一章 文献综述
1.1 绵羊的繁殖生理
1.2 支持细胞研究进展
1.2.1 支持细胞形态结构和功能
1.2.2 支持细胞体外培养的意义
1.3 减数分裂与联会复合体研究进展
1.4 联会复合体相关蛋白分类及功能研究
1.5 SYCE1研究进展
1.5.1 SYCE1在生殖领域的研究进展
1.6 siRNA技术的认识
1.7 研究的目的和意义
第二章 绵羊SYCE1基因克隆及序列分析
2.1 材料与方法
2.1.1 材料
2.2 试剂与仪器
2.2.1 试剂
2.2.2 仪器
2.3 方法
2.3.1 提取绵羊睾丸组织Total RNA及 qPCR
2.3.2.1 引物设计及合成
2.3.2 RT-PCR
2.3.3 目的基因PCR扩增
2.3.4 目的片段回收与纯化PCR产物
2.3.5 SYCE1的载体连接、克隆及测序
2.3.5.1 PCR产物连接pEASY-Blunt克隆载体
2.3.5.2 连接产物的转化
2.3.5.3 转化菌的筛选与鉴定
2.3.6 序列分析
2.3.6.1 核苷酸和氨基酸序列分析[63]
2.4 结果与分析
2.4.1 绵羊SYCE1基因的克隆与序列分析
2.4.2 绵羊SYCE1理化性质分析
2.4.3 SYCE1蛋白质结构预测分析
2.4.4 绵羊SYCE1氨基酸序列在不同种间的相似性分析
2.4.5 SYCE1蛋白的保守性分析
2.5 讨论
2.6 小结
第三章 绵羊SYCE1基因在雄性生殖轴系上的表达
3.1 材料与方法
3.1.1 材料
3.2 试剂与仪器
3.2.1 试剂
3.2.2 仪器
3.3 方法
3.3.1 提取绵羊各个组织Total RNA及 qPCR
3.3.2 qRT-PCR
3.3.2.1 引物设计及合成
3.3.3 免疫组化法
3.3.4 总蛋白提取
3.4 统计学分析
3.5 结果与分析
3.5.1 雄性绵羊睾丸轴系中SYCE1在mRNA和蛋白水平的表达
3.5.2 Western Blotting验证SYCE1 蛋白在绵羊生殖轴的表达
3.5.3 SYCE1阳性细胞在雄性绵羊睾丸轴系的分布定位
3.6 讨论
3.7 小结
第四章 SYCE1基因在绵羊不同年龄阶段睾丸组织中的表达
4.1 材料与方法
4.1.1 材料
4.1.2 主要试剂
4.2 方法
4.2.1 不同发育阶段绵羊睾丸RNA的提取与反转录
4.2.2 免疫组化和石蜡切片免疫荧光染色检测SYCE1蛋白在不同年龄阶段绵羊睾丸中的定位
4.3 结果与分析
4.3.1 qRT-PCR检测SYCE1 mRNA在不同年龄阶段绵羊睾丸中的表达
4.3.2 Western Blotting检测SYCE1 蛋白在不同年龄阶绵羊睾丸中的表达
4.3.3 SYCE1阳性细胞在绵羊不同年龄阶段睾丸组织中分布定位
4.4 讨论
4.5 小结
第五章 SYCE1对绵羊原代培养分离睾丸支持细胞增殖的研究
5.1 材料与方法
5.1.1 样品
5.1.2 试剂与仪器
5.1.2.1 试剂
5.1.2.2 溶液
5.2 绵羊睾丸分离支持细胞的原代培养及纯化
5.2.1 绵羊支持细胞的原代培养
5.2.2 绵羊支持细胞的纯化
5.3 绵羊睾丸支持细胞的鉴定
5.3.1 ABP免疫荧光染色
5.3.2 绵羊支持细胞Feulgen染色
5.3.3 绵羊支持细胞HE染色
5.4 靶向SYCE1 基因siRNA合成及转染
5.5 靶向SYCE1 基因过表达载体PEGFP-C1-SYCE1 构建、鉴定及转染
5.5.1 载体构建基本信息
5.5.2 RT-PCR扩增目的基因SYCE1
5.5.2.1 目的基因SYCE1(双酶切位点XhoI和 SacII)
5.5.2.2 PCR扩增产物的切割及回收
5.5.3 pEGFP-C1-SYCE1 载体构建
5.5.3.1 连接
5.5.3.2 转化及重组质粒双酶切验证
5.5.4 pEGFP-C1-SYCE1 重组质粒的扩增和提取
5.5.5 转染原代绵羊支持细胞
5.5.6 CCK8法测定细胞增殖
5.5.7 流式细胞检测
5.6 荧光定量检测Cyclin D1和PCNA基因m RNA的表达
5.7 数据统计与分析
5.8 结果和分析
5.8.1 绵羊原代睾丸支持细胞的分离培养
5.8.2 支持细胞的鉴定
5.8.3 pEGFP-C1-SYCE1 过表达载体构建及检测
5.8.4 siRNA-SYCE1 的合成及沉默效果检测
5.8.5 细胞免疫荧光
5.8.6 过表达SYCE1基因对绵羊原代支持细胞增殖的作用
5.8.6.1 流式细胞检测及CCK8检测
5.8.7 沉默SYCE1基因对原代支持细胞增殖的作用
5.8.7.1 流式细胞检测及CCK8检测
5.8.8 SYCE1基因过表达对支持细胞增殖基因的影响
5.8.9 SYCE1基因沉默对支持细胞增殖基因的影响
5.9 讨论
5.10 结论
第六章 全文总结
参考文献
致谢
作者简介
在读期间发表论文和研究成果等
导师简介
【参考文献】：
期刊论文
[1]山羊睾丸支持细胞分离培养及其氧化应激效果研究[J]. 王菊花,刘丹丹,刘琦,王佳明,董静,周杰,薛秀恒. 中国农业大学学报. 2019(02)
[2]小鼠Nlrp基因家族生物信息学分析[J]. 罗荣松,冯郁,宋明民,左永春,李光鹏. 基因组学与应用生物学. 2018(03)
[3]羊的繁殖配种技术[J]. 王云锋. 黑龙江动物繁殖. 2017(06)
[4]天祝白牦牛HSP60基因的克隆及其在下丘脑-垂体-睾丸中的表达定位研究[J]. 阮崇美,王相生,张勇,马友记,胡俊杰,赵兴绪. 核农学报. 2017(07)
[5]PDGFRA基因对牛未成熟支持细胞体外增殖的影响[J]. 高一,秦立红,房希碧,东雪,赵玉民,张国梁. 吉林农业大学学报. 2018(03)
[6]促性腺激素释放激素拮抗剂在下丘脑垂体外生殖系统中的作用及临床应用[J]. 陈骞. 生殖医学杂志. 2016(04)
[7]同期发情处理绵羊发情规律探讨[J]. 包花拉,莫德日乐吐,王海军,黄晓刚,闫俊,王建国. 畜牧与饲料科学. 2015(11)
[8]中国卵巢早衰妇女全基因组染色体拷贝数变异分析[J]. 甄秀梅,孙义民,乔杰,李蓉,王丽娜,刘平. 北京大学学报(医学版). 2013(06)
[9]绵羊繁殖性状相关基因研究进展[J]. 孟丽娜,张英杰,刘月琴. 中国草食动物科学. 2012(S1)
[10]牛羊的生理生产指标[J]. 陈晓霞. 养殖技术顾问. 2009(06)
博士论文
[1]MTA2在睾丸支持细胞中的表达及功能研究[D]. 张顺.第四军医大学 2013
硕士论文
[1]高原甘加藏羊发情周期下丘脑GnRH的动态分泌及其受体在垂体和卵巢中表达[D]. 葛闻博.甘肃农业大学 2018
本文编号：3671998
【文章页数】：68 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
缩略词对照表
中文摘要
SUMMARY
第一章 文献综述
1.1 绵羊的繁殖生理
1.2 支持细胞研究进展
1.2.1 支持细胞形态结构和功能
1.2.2 支持细胞体外培养的意义
1.3 减数分裂与联会复合体研究进展
1.4 联会复合体相关蛋白分类及功能研究
1.5 SYCE1研究进展
1.5.1 SYCE1在生殖领域的研究进展
1.6 siRNA技术的认识
1.7 研究的目的和意义
第二章 绵羊SYCE1基因克隆及序列分析
2.1 材料与方法
2.1.1 材料
2.2 试剂与仪器
2.2.1 试剂
2.2.2 仪器
2.3 方法
2.3.1 提取绵羊睾丸组织Total RNA及 qPCR
2.3.2.1 引物设计及合成
2.3.2 RT-PCR
2.3.3 目的基因PCR扩增
2.3.4 目的片段回收与纯化PCR产物
2.3.5 SYCE1的载体连接、克隆及测序
2.3.5.1 PCR产物连接pEASY-Blunt克隆载体
2.3.5.2 连接产物的转化
2.3.5.3 转化菌的筛选与鉴定
2.3.6 序列分析
2.3.6.1 核苷酸和氨基酸序列分析[63]
2.4 结果与分析
2.4.1 绵羊SYCE1基因的克隆与序列分析
2.4.2 绵羊SYCE1理化性质分析
2.4.3 SYCE1蛋白质结构预测分析
2.4.4 绵羊SYCE1氨基酸序列在不同种间的相似性分析
2.4.5 SYCE1蛋白的保守性分析
2.5 讨论
2.6 小结
第三章 绵羊SYCE1基因在雄性生殖轴系上的表达
3.1 材料与方法
3.1.1 材料
3.2 试剂与仪器
3.2.1 试剂
3.2.2 仪器
3.3 方法
3.3.1 提取绵羊各个组织Total RNA及 qPCR
3.3.2 qRT-PCR
3.3.2.1 引物设计及合成
3.3.3 免疫组化法
3.3.4 总蛋白提取
3.4 统计学分析
3.5 结果与分析
3.5.1 雄性绵羊睾丸轴系中SYCE1在mRNA和蛋白水平的表达
3.5.2 Western Blotting验证SYCE1 蛋白在绵羊生殖轴的表达
3.5.3 SYCE1阳性细胞在雄性绵羊睾丸轴系的分布定位
3.6 讨论
3.7 小结
第四章 SYCE1基因在绵羊不同年龄阶段睾丸组织中的表达
4.1 材料与方法
4.1.1 材料
4.1.2 主要试剂
4.2 方法
4.2.1 不同发育阶段绵羊睾丸RNA的提取与反转录
4.2.2 免疫组化和石蜡切片免疫荧光染色检测SYCE1蛋白在不同年龄阶段绵羊睾丸中的定位
4.3 结果与分析
4.3.1 qRT-PCR检测SYCE1 mRNA在不同年龄阶段绵羊睾丸中的表达
4.3.2 Western Blotting检测SYCE1 蛋白在不同年龄阶绵羊睾丸中的表达
4.3.3 SYCE1阳性细胞在绵羊不同年龄阶段睾丸组织中分布定位
4.4 讨论
4.5 小结
第五章 SYCE1对绵羊原代培养分离睾丸支持细胞增殖的研究
5.1 材料与方法
5.1.1 样品
5.1.2 试剂与仪器
5.1.2.1 试剂
5.1.2.2 溶液
5.2 绵羊睾丸分离支持细胞的原代培养及纯化
5.2.1 绵羊支持细胞的原代培养
5.2.2 绵羊支持细胞的纯化
5.3 绵羊睾丸支持细胞的鉴定
5.3.1 ABP免疫荧光染色
5.3.2 绵羊支持细胞Feulgen染色
5.3.3 绵羊支持细胞HE染色
5.4 靶向SYCE1 基因siRNA合成及转染
5.5 靶向SYCE1 基因过表达载体PEGFP-C1-SYCE1 构建、鉴定及转染
5.5.1 载体构建基本信息
5.5.2 RT-PCR扩增目的基因SYCE1
5.5.2.1 目的基因SYCE1(双酶切位点XhoI和 SacII)
5.5.2.2 PCR扩增产物的切割及回收
5.5.3 pEGFP-C1-SYCE1 载体构建
5.5.3.1 连接
5.5.3.2 转化及重组质粒双酶切验证
5.5.4 pEGFP-C1-SYCE1 重组质粒的扩增和提取
5.5.5 转染原代绵羊支持细胞
5.5.6 CCK8法测定细胞增殖
5.5.7 流式细胞检测
5.6 荧光定量检测Cyclin D1和PCNA基因m RNA的表达
5.7 数据统计与分析
5.8 结果和分析
5.8.1 绵羊原代睾丸支持细胞的分离培养
5.8.2 支持细胞的鉴定
5.8.3 pEGFP-C1-SYCE1 过表达载体构建及检测
5.8.4 siRNA-SYCE1 的合成及沉默效果检测
5.8.5 细胞免疫荧光
5.8.6 过表达SYCE1基因对绵羊原代支持细胞增殖的作用
5.8.6.1 流式细胞检测及CCK8检测
5.8.7 沉默SYCE1基因对原代支持细胞增殖的作用
5.8.7.1 流式细胞检测及CCK8检测
5.8.8 SYCE1基因过表达对支持细胞增殖基因的影响
5.8.9 SYCE1基因沉默对支持细胞增殖基因的影响
5.9 讨论
5.10 结论
第六章 全文总结
参考文献
致谢
作者简介
在读期间发表论文和研究成果等
导师简介
【参考文献】：
期刊论文
[1]山羊睾丸支持细胞分离培养及其氧化应激效果研究[J]. 王菊花,刘丹丹,刘琦,王佳明,董静,周杰,薛秀恒. 中国农业大学学报. 2019(02)
[2]小鼠Nlrp基因家族生物信息学分析[J]. 罗荣松,冯郁,宋明民,左永春,李光鹏. 基因组学与应用生物学. 2018(03)
[3]羊的繁殖配种技术[J]. 王云锋. 黑龙江动物繁殖. 2017(06)
[4]天祝白牦牛HSP60基因的克隆及其在下丘脑-垂体-睾丸中的表达定位研究[J]. 阮崇美,王相生,张勇,马友记,胡俊杰,赵兴绪. 核农学报. 2017(07)
[5]PDGFRA基因对牛未成熟支持细胞体外增殖的影响[J]. 高一,秦立红,房希碧,东雪,赵玉民,张国梁. 吉林农业大学学报. 2018(03)
[6]促性腺激素释放激素拮抗剂在下丘脑垂体外生殖系统中的作用及临床应用[J]. 陈骞. 生殖医学杂志. 2016(04)
[7]同期发情处理绵羊发情规律探讨[J]. 包花拉,莫德日乐吐,王海军,黄晓刚,闫俊,王建国. 畜牧与饲料科学. 2015(11)
[8]中国卵巢早衰妇女全基因组染色体拷贝数变异分析[J]. 甄秀梅,孙义民,乔杰,李蓉,王丽娜,刘平. 北京大学学报(医学版). 2013(06)
[9]绵羊繁殖性状相关基因研究进展[J]. 孟丽娜,张英杰,刘月琴. 中国草食动物科学. 2012(S1)
[10]牛羊的生理生产指标[J]. 陈晓霞. 养殖技术顾问. 2009(06)
博士论文
[1]MTA2在睾丸支持细胞中的表达及功能研究[D]. 张顺.第四军医大学 2013
硕士论文
[1]高原甘加藏羊发情周期下丘脑GnRH的动态分泌及其受体在垂体和卵巢中表达[D]. 葛闻博.甘肃农业大学 2018
本文编号：3671998
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