藏系绵羊GSDMA基因皮肤特异表达载体的构建
发布时间：2022-08-11 21:29
本研究的目的是构建藏系绵羊Gasdermin基因家族成员GSDMA基因的表达载体,在细胞水平上探索GSDMA基因在毛囊细胞中可能发挥的调控机制,为进一步研究绵羊GSDMA基因在毛囊发育与周期变化中的功能提供理论基础。试验以藏系绵羊母羊为研究对象,从皮肤中克隆了藏系绵羊GSDMA基因序列,并以此为基础构建了皮肤特异的真核表达载体,进一步转染体外培养的人毛囊内根鞘细胞（Human hair inner root sheath cells,HHIRSC）,利用荧光定量PCR及Western blot检测藏系绵羊GSDMA基因以及与毛囊生长发育相关的Wnt通路信号分子β-catenin基因m RNA和蛋白质水平的变化。主要研究成果如下:（1）获得了藏系绵羊GSDMA基因的CDS编码区序列,长度为1341 bp。CDS区序列比对显示,GSDMA基因与预测的绵羊序列存2个碱基差异,但氨基酸序列相同。（2）以pCDs Red2-KI真核载体为骨架,构建了含KAP6.1皮肤特异表达启动子的GSDMA基因重组真核载体p CDs R-KG。（3）将p CDs R-KG转染HHIRSC,用流式细胞术分选红色...
【文章页数】：49 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
摘要
ABSTRACT
前言
第1章 文献综述
1 毛囊与羊绒毛性状
2 羊绒毛性状的主要候选基因
2.1 BMP基因家族
2.2 Hox基因家族
2.3 FGFs
2.4 胰岛素样生长因子
2.5 GSDMA
第2章 藏系绵羊GSDMA基因的克隆与表达载体的构建
1 实验材料
1.1 样品的采集与处理
1.2 主要试剂与仪器
2 实验方法
2.1 总RNA的提取与PCR扩增
2.2 基因的克隆测序及双酶切引物设计
2.3 含酶切位点GSDMA基因和pCDsRed2-KI载体的扩增
2.4 皮肤特异表达载体pCDsR-KG的构建
2.5 pCDsR-KG载体的鉴定
3 结果与分析
3.1 藏系绵羊GSDMA基因的PCR扩增
3.2 GSDMA的基因克隆
3.3 测序及分析
3.4 GSDMA基因扩增和真核载体的转化
3.5 pCDsRed2-KG真核载体的鉴定
4.讨论
第3章 GSDMA基因真核载体的转染及功能分析
1 实验材料
1.1 样品
1.2 主要试剂与仪器
2 实验方法
2.1 HHIRSC细胞的复苏与传代
2.2 转染条件优化
2.3 pCDsR-KG载体的转染与筛选
2.4 流式细胞术筛选转染细胞
2.5 筛选后细胞RNA及总蛋白的获得
2.6 GSDMA及 β-catenin基因荧光定量PCR分析
2.7 Western blot分析 β-catenin蛋白表达差异
3 结果与分析
3.1 转染条件优化
3.2 转染结果分析
3.3 流式细胞术筛选转染细胞
3.4 实验细胞RNA及总蛋白的获得
3.5 GSDMA及 β-catenin基因的定量
3.6 β-catenin基因的蛋白水平分析
4 讨论
结论
参考文献
附录
致谢
【参考文献】：
期刊论文
[1]牦牛和雄性不育犏牛睾丸FABP5和FABP9基因mRNA水平及能量代谢相关酶活力的比较[J]. 付伟,黄林,刘文静,任亮,李彩霞,金素钰,林亚秋,郑玉才. 畜牧兽医学报. 2015(04)
[2]与毛囊生长发育及羊毛、羊绒品质相关基因的研究进展[J]. 田月珍,黄锡霞,柏妍,田可川,徐新明,吴伟伟,哈尼克孜. 中国草食动物科学. 2013(03)
[3]藏系绵羊遗传多样性的研究进展[J]. 徐琳娜,李国林. 畜牧兽医杂志. 2012(04)
[4]海西州高原型藏羊种质资源调查[J]. 王光明. 畜牧与兽医. 2012(04)
[5]山羊IGFBP-3基因的遗传分析及其与经济性状的关系[J]. 李美玉,李兰,闵令江,王建民. 畜牧兽医学报. 2008(12)
[6]IGF-Ⅰ对不同绵羊皮肤中5个毛囊相关生长因子基因表达的影响[J]. 李岩,廖和荣,李知勉,孙杰,李大全. 中国农业科学. 2007(03)
[7]GSDMDC家族的基因功能[J]. 孙乔,张令强,贺福初. 遗传. 2006(05)
[8]青海藏羊毛纤维物理性能分析[J]. 张惠萍,颜寿东,吴成顺. 中国草食动物. 2005(03)
[9]我国羊毛进口增长的影响及其成因分析[J]. 王丽娜,顾国达. 国际贸易问题. 2004(05)
[10]与绒山羊绒毛生长相关指标的研究进展[J]. 邵美丽,单玉兰,刘皙洁. 黑龙江畜牧兽医. 2004(04)
博士论文
[1]成纤维细胞生长因子5（FGF5）基因cDNA克隆及在不同品种绵羊和山羊中的多态性研究[D]. 高爱琴.内蒙古农业大学 2005
[2]内蒙古绒山羊毛囊发育、生长周期及相关基因的研究[D]. 尹俊.内蒙古大学 2004
硕士论文
[1]角蛋白关联蛋白基因（KAP和KRT）与绵羊毛品质的相关性研究[D]. 许汉峰.石河子大学 2008
本文编号：3675424
【文章页数】：49 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
摘要
ABSTRACT
前言
第1章 文献综述
1 毛囊与羊绒毛性状
2 羊绒毛性状的主要候选基因
2.1 BMP基因家族
2.2 Hox基因家族
2.3 FGFs
2.4 胰岛素样生长因子
2.5 GSDMA
第2章 藏系绵羊GSDMA基因的克隆与表达载体的构建
1 实验材料
1.1 样品的采集与处理
1.2 主要试剂与仪器
2 实验方法
2.1 总RNA的提取与PCR扩增
2.2 基因的克隆测序及双酶切引物设计
2.3 含酶切位点GSDMA基因和pCDsRed2-KI载体的扩增
2.4 皮肤特异表达载体pCDsR-KG的构建
2.5 pCDsR-KG载体的鉴定
3 结果与分析
3.1 藏系绵羊GSDMA基因的PCR扩增
3.2 GSDMA的基因克隆
3.3 测序及分析
3.4 GSDMA基因扩增和真核载体的转化
3.5 pCDsRed2-KG真核载体的鉴定
4.讨论
第3章 GSDMA基因真核载体的转染及功能分析
1 实验材料
1.1 样品
1.2 主要试剂与仪器
2 实验方法
2.1 HHIRSC细胞的复苏与传代
2.2 转染条件优化
2.3 pCDsR-KG载体的转染与筛选
2.4 流式细胞术筛选转染细胞
2.5 筛选后细胞RNA及总蛋白的获得
2.6 GSDMA及 β-catenin基因荧光定量PCR分析
2.7 Western blot分析 β-catenin蛋白表达差异
3 结果与分析
3.1 转染条件优化
3.2 转染结果分析
3.3 流式细胞术筛选转染细胞
3.4 实验细胞RNA及总蛋白的获得
3.5 GSDMA及 β-catenin基因的定量
3.6 β-catenin基因的蛋白水平分析
4 讨论
结论
参考文献
附录
致谢
【参考文献】：
期刊论文
[1]牦牛和雄性不育犏牛睾丸FABP5和FABP9基因mRNA水平及能量代谢相关酶活力的比较[J]. 付伟,黄林,刘文静,任亮,李彩霞,金素钰,林亚秋,郑玉才. 畜牧兽医学报. 2015(04)
[2]与毛囊生长发育及羊毛、羊绒品质相关基因的研究进展[J]. 田月珍,黄锡霞,柏妍,田可川,徐新明,吴伟伟,哈尼克孜. 中国草食动物科学. 2013(03)
[3]藏系绵羊遗传多样性的研究进展[J]. 徐琳娜,李国林. 畜牧兽医杂志. 2012(04)
[4]海西州高原型藏羊种质资源调查[J]. 王光明. 畜牧与兽医. 2012(04)
[5]山羊IGFBP-3基因的遗传分析及其与经济性状的关系[J]. 李美玉,李兰,闵令江,王建民. 畜牧兽医学报. 2008(12)
[6]IGF-Ⅰ对不同绵羊皮肤中5个毛囊相关生长因子基因表达的影响[J]. 李岩,廖和荣,李知勉,孙杰,李大全. 中国农业科学. 2007(03)
[7]GSDMDC家族的基因功能[J]. 孙乔,张令强,贺福初. 遗传. 2006(05)
[8]青海藏羊毛纤维物理性能分析[J]. 张惠萍,颜寿东,吴成顺. 中国草食动物. 2005(03)
[9]我国羊毛进口增长的影响及其成因分析[J]. 王丽娜,顾国达. 国际贸易问题. 2004(05)
[10]与绒山羊绒毛生长相关指标的研究进展[J]. 邵美丽,单玉兰,刘皙洁. 黑龙江畜牧兽医. 2004(04)
博士论文
[1]成纤维细胞生长因子5（FGF5）基因cDNA克隆及在不同品种绵羊和山羊中的多态性研究[D]. 高爱琴.内蒙古农业大学 2005
[2]内蒙古绒山羊毛囊发育、生长周期及相关基因的研究[D]. 尹俊.内蒙古大学 2004
硕士论文
[1]角蛋白关联蛋白基因（KAP和KRT）与绵羊毛品质的相关性研究[D]. 许汉峰.石河子大学 2008
本文编号：3675424
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