落叶松启动子元件挖掘及基因组编辑实现

发布时间：2023-02-18 09:59

　　落叶松(Larix kaempferi)是一种落叶乔木,具有早期速生、抗逆性强、抗病优良、生态效益好的特点,是我国北方地区十分重要的造林树种,被广泛应用于防护林及退耕还林建设。但由于落叶松生长周期长、无性扩繁技术复杂且效率低,一定程度上制约了其遗传改良进程。随着现代基因工程技术的日趋成熟及基于CRISPR-Cas基因组编辑技术的发展,为落叶松重要性状快速改良带来了机遇。然而,目前落叶松参考基因组序列图谱组装仍未完成、遗传转化体系尚不成熟、基因组工程核心元件储备有限,使得基于基因组工程的落叶松种质创新操作难以有效实施。针对以上落叶松基因组工程实践中的瓶颈问题,本研究首先构建基于原生质体转化体系的落叶松瞬时表达检测体系,其次基于“基因组-转录组”通量测序比对分析策略进行落叶松高活性启动子挖掘,进而针对落叶松基因组结构及表达特性构建有效的外源基因过表达及内源位点基因组编辑系统。本研究主要结果如下:1、确认了落叶松原生质体分离、提取、纯化及转化关键参数,有效建立了落叶松原生质体瞬时表达体系:针对落叶松原生质体制备、转化中的酶浓度、甘露醇浓度、酶解时间、PEG 4000浓度及分离纯化条件进行验证...

【文章页数】：72 页

【学位级别】：硕士

【文章目录】：
摘要
abstract
第一章 绪论
    1.1 落叶松基因组工程研究进展
        1.1.1 落叶松概述
        1.1.2 落叶松分子生物学进展
        1.1.3 落叶松基因组工程研究
    1.2 植物原生质体转化进展
        1.2.1 原生质体特性及转化应用
        1.2.2 原生质体分离纯化方法
        1.2.3 原生质体瞬时转化方法
    1.3 植物转录调控元件研究概况
        1.3.1 植物转录调控元件分类
        1.3.2 植物启动子元件主要类别及应用
        1.3.3 植物启动子元件分离及鉴定方法
    1.4 植物CRISPR-Cas9 基因组编辑系统
        1.4.1 CRISPR-Cas9 工作原理简介
        1.4.2 CRISPR-Cas9 植物基因组编辑系统核心元件
    1.5 立题依据
    1.6 研究内容
第二章 材料与方法
    2.1 实验材料
        2.1.1 植物材料
        2.1.2 工程菌株
    2.2 实验试剂
    2.3 实验仪器
    2.4 实验方法
        2.4.1 落叶松胚性愈伤组织诱导培养
        2.4.2 落叶松原生质体细胞计数及活性检测
        2.4.3 落叶松原生质体制备及转化
        2.4.4 落叶松基因组DNA提取
        2.4.5 落叶松基因组及转录组通量测序
        2.4.6 落叶松候选启动子元件分离及报告载体构建
        2.4.7 落叶松CRISPR-Cas9 基因组编辑载体构建
        2.4.8 水稻原生质体制备及转化
        2.4.9 水稻稳定遗传转化
第三章 结果与分析
    3.1 落叶松原生质体瞬时表达体系构建
        3.1.1 落叶松愈伤组织诱导培养
        3.1.2 落叶松原生质体分离制备关键参数优化
        3.1.3 落叶松原生质体瞬时转化关键参数确定
        3.1.4 落叶松原生质体瞬时转化方法
    3.2 落叶松启动子元件挖掘及鉴定
        3.2.1 基于通量测序技术的落叶松高效候选启动子挖掘
        3.2.2 落叶松候选启动子关键元件分析
        3.2.3 落叶松候选启动子分离鉴定
        3.2.4 落叶松候选启动子转录活性比较分析
        3.2.5 落叶松启动子在植物基因组工程中的应用
    3.3 基于CRISPR-Cas9 的落叶松基因组编辑实现
        3.3.1 落叶松目标基因序列确认
        3.3.2 落叶松CRISPR-Cas9 向导RNA设计
        3.3.3 落叶松基因组编辑事件分析及确认
第四章 讨论
    4.1 落叶松原生质体瞬时表达体系有效建立及优化
    4.2 落叶松启动子元件有效挖掘策略及应用
    4.3 落叶松CRISPR-Cas9 基因组编辑体系建立及优化
第五章 结论
致谢
参考文献
攻硕期间取得的研究成果



本文编号：3744745