柔嫩艾美耳球虫丝氨酸/苏氨酸磷酸蛋白酶和ASNA1同源ATP酶特性研究
发布时间：2023-10-14 09:23
鸡球虫病是由几种艾美耳球虫寄生鸡肠道引起的一种严重的寄生虫病。目前,该病主要还是依赖于药物防治,抗球虫药物的广泛使用也加剧了球虫耐药性的产生。然而至今都没有找到球虫耐药性形成的机制,也没有找到控制球虫产生耐药性的靶基因。为了深入研究球虫耐药性产生的分子机制,我们实验室前期以柔嫩艾美耳球虫敏感株为基础分别诱导了对地克珠利和马杜拉霉素耐药的虫株,并利用转录组测序的方法对这两株耐药株以及柔嫩艾美耳球虫敏感株进行比较分析,成功获得了在敏感株和耐药株中差异表达的基因。本研究从差异表达基因中,选取了在两株耐药株中均显著上调表达的2个基因进行相关研究,这2个基因为柔嫩艾美耳球虫丝氨酸/苏氨酸蛋白磷酸酶(EtSTP)和ASNA1同源ATP酶(EtASNA1)。1.EtSTP和EtASNA1基因的克隆和表达以柔嫩艾美耳球虫敏感株cDNA第一链为模板,成功克隆了 EtSTP和EtASNA1基因,核苷酸序列分析表明,EtSTP的开放阅读框序列含528 bp,编码175个氨基酸残基,预测分子量为19.0 kDa;EtASNA1的开放阅读框序列含408 bp,编码135个氨基酸残基,预测分子量为14.6 kDa...
【文章页数】：80 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
摘要
Abstract
英文缩略表
第1章 文献综述
1.1 鸡球虫病概述
1.2 抗球虫药物作用机理及耐药机制
1.2.1 聚醚离子载体类药物
1.2.2 化学合成类
1.3 鸡球虫耐药性的检测方法
1.3.1 笼饲试验
1.3.2 细胞检测
1.4 耐药虫株的诱导
1.5 耐药相关基因的研究
1.6 展望
第2章 EtSTP和EtASNA1基因的克隆和表达
2.1 引言
2.2 材料和方法
2.2.1 实验虫株和实验动物
2.2.2 实验试剂
2.2.3 实验仪器
2.2.4 柔嫩艾美耳球虫孢子化卵囊的收集与纯化
2.2.5 孢子化卵囊总RNA的提取和cDNA第一链的制备
2.2.6 基因的克隆及生物信息学分析
2.2.7 原核重组表达质粒的构建
2.2.8 重组蛋白的表达与纯化
2.2.9 重组蛋白反应原性的检测
2.3 实验结果
2.3.1 柔嫩艾美耳球虫孢子化卵囊的收集与纯化
2.3.2 孢子化卵囊总RNA的提取
2.3.3 基因的克隆和序列分析
2.3.4 重组蛋白的表达与纯化
2.3.5 重组蛋白反应原性的分析
2.4 讨论
第3章 EtSTP与EtASNA1蛋白特性和功能的初步分析
3.1 引言
3.2 材料和方法
3.2.1 实验虫株、动物和细胞
3.2.2 实验试剂
3.2.3 实验仪器
3.2.4 柔嫩艾美耳球虫敏感株四个阶段虫体的收集与纯化
3.2.5 qPCR分析EtSTP和EtASNA1在柔嫩艾美耳球虫敏感株四个发育阶段的mRNA转录水平
3.2.6 重组蛋白多克隆抗体的制备及IgG的纯化
3.2.7 Western Blot分析EtSTP和EtASNA1在柔嫩艾美耳球虫敏感株四个发育阶段的蛋白翻译水平
3.2.8 EtSTP和EtASNA1在虫体中的分布定位
3.2.9 兔抗重组蛋白多克隆抗体对子孢子入侵DF-1细胞的影响
3.2.10 数据分析
3.3 结果
3.3.1 EtSTP和EtASNA1在柔嫩艾美耳球虫不同发育阶段的mRNA转录水平
3.3.2 EtSTP和EtASNA1在柔嫩艾美耳球虫不同发育阶段的翻译水平
3.3.3 EtSTP和EtASNA1在柔嫩艾美耳球虫体内的分布定位
3.3.4 兔抗重组蛋白rEtSTP和rEtASNA1多克隆抗体对子孢子体外入侵DF-1细胞的影响
3.4 讨论
第4章 EtSTP和EtASNA1在柔嫩艾美耳球虫敏感株与耐药株中的差异分析
4.1 引言
4.2 材料和方法
4.2.1 实验虫株和实验动物
4.2.2 实验试剂
4.2.3 实验仪器
4.2.4 柔嫩艾美耳球虫耐药株的传代,收集与纯化
4.2.5 敏感株与耐药株第二代裂殖子超微结构比较
4.2.6 药物孵育对子孢子入侵DF-1细胞的影响
4.2.7 RNA的提取和cDNA第一链的合成
4.2.8 EtSTP和EtASNA1在敏感株和耐药株中DNA的扩增与比较
4.2.9 EtSTP和EtASNA1在敏感株和耐药株中转录水平的分析
4.2.10 EtSTP和EtASNA1在敏感株和耐药株中蛋白翻译水平的分析
4.3 结果
4.3.1 敏感株与耐药株第二代裂殖子的透射电镜观察
4.3.2 药物孵育对子孢子入侵DF-1细胞的影响
4.3.3 比较敏感株和耐药株EtSTP和EtASNA1的DNA序列
4.3.4 EtSTP在敏感株和地克珠利耐药株及马杜拉霉素耐药株中的表达水平
4.3.5 EtASNA1在敏感株和地克珠利耐药株及马杜拉霉素耐药株中的表达水平
4.4 讨论
第5章 qPCR检测EtSTP和EtASNA1在不同耐药株中的转录水平
5.1 引言
5.2 材料和方法
5.2.1 实验虫株和实验动物
5.2.2 实验试剂
5.2.3 实验仪器
5.2.4 不同浓度耐药株转录水平的研究
5.2.5 野生地克珠利耐药株转录水平的研究
5.2.6 药物作用后对EtSTP和EtASNA1转录水平的影响
5.3 结果
5.3.1 EtSTP和EtASNA1在不同浓度耐药株转录水平的比较
5.3.2 野生地克珠利耐药株中EtSTP和EtASNA1的mRNA转录水平的研究
5.3.3 体外培养观察药物作用虫体后对EtSTP和EtASNA1 mRNA转录水平的影响
5.3.4 体内试验观察药物作用虫体后对EtSTP和EtASNA1转录水平的影响
5.4 讨论
第6章 全文总结
参考文献
攻读学位期间取得的研究成果
致谢
本文编号：3854044
【文章页数】：80 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
摘要
Abstract
英文缩略表
第1章 文献综述
1.1 鸡球虫病概述
1.2 抗球虫药物作用机理及耐药机制
1.2.1 聚醚离子载体类药物
1.2.2 化学合成类
1.3 鸡球虫耐药性的检测方法
1.3.1 笼饲试验
1.3.2 细胞检测
1.4 耐药虫株的诱导
1.5 耐药相关基因的研究
1.6 展望
第2章 EtSTP和EtASNA1基因的克隆和表达
2.1 引言
2.2 材料和方法
2.2.1 实验虫株和实验动物
2.2.2 实验试剂
2.2.3 实验仪器
2.2.4 柔嫩艾美耳球虫孢子化卵囊的收集与纯化
2.2.5 孢子化卵囊总RNA的提取和cDNA第一链的制备
2.2.6 基因的克隆及生物信息学分析
2.2.7 原核重组表达质粒的构建
2.2.8 重组蛋白的表达与纯化
2.2.9 重组蛋白反应原性的检测
2.3 实验结果
2.3.1 柔嫩艾美耳球虫孢子化卵囊的收集与纯化
2.3.2 孢子化卵囊总RNA的提取
2.3.3 基因的克隆和序列分析
2.3.4 重组蛋白的表达与纯化
2.3.5 重组蛋白反应原性的分析
2.4 讨论
第3章 EtSTP与EtASNA1蛋白特性和功能的初步分析
3.1 引言
3.2 材料和方法
3.2.1 实验虫株、动物和细胞
3.2.2 实验试剂
3.2.3 实验仪器
3.2.4 柔嫩艾美耳球虫敏感株四个阶段虫体的收集与纯化
3.2.5 qPCR分析EtSTP和EtASNA1在柔嫩艾美耳球虫敏感株四个发育阶段的mRNA转录水平
3.2.6 重组蛋白多克隆抗体的制备及IgG的纯化
3.2.7 Western Blot分析EtSTP和EtASNA1在柔嫩艾美耳球虫敏感株四个发育阶段的蛋白翻译水平
3.2.8 EtSTP和EtASNA1在虫体中的分布定位
3.2.9 兔抗重组蛋白多克隆抗体对子孢子入侵DF-1细胞的影响
3.2.10 数据分析
3.3 结果
3.3.1 EtSTP和EtASNA1在柔嫩艾美耳球虫不同发育阶段的mRNA转录水平
3.3.2 EtSTP和EtASNA1在柔嫩艾美耳球虫不同发育阶段的翻译水平
3.3.3 EtSTP和EtASNA1在柔嫩艾美耳球虫体内的分布定位
3.3.4 兔抗重组蛋白rEtSTP和rEtASNA1多克隆抗体对子孢子体外入侵DF-1细胞的影响
3.4 讨论
第4章 EtSTP和EtASNA1在柔嫩艾美耳球虫敏感株与耐药株中的差异分析
4.1 引言
4.2 材料和方法
4.2.1 实验虫株和实验动物
4.2.2 实验试剂
4.2.3 实验仪器
4.2.4 柔嫩艾美耳球虫耐药株的传代,收集与纯化
4.2.5 敏感株与耐药株第二代裂殖子超微结构比较
4.2.6 药物孵育对子孢子入侵DF-1细胞的影响
4.2.7 RNA的提取和cDNA第一链的合成
4.2.8 EtSTP和EtASNA1在敏感株和耐药株中DNA的扩增与比较
4.2.9 EtSTP和EtASNA1在敏感株和耐药株中转录水平的分析
4.2.10 EtSTP和EtASNA1在敏感株和耐药株中蛋白翻译水平的分析
4.3 结果
4.3.1 敏感株与耐药株第二代裂殖子的透射电镜观察
4.3.2 药物孵育对子孢子入侵DF-1细胞的影响
4.3.3 比较敏感株和耐药株EtSTP和EtASNA1的DNA序列
4.3.4 EtSTP在敏感株和地克珠利耐药株及马杜拉霉素耐药株中的表达水平
4.3.5 EtASNA1在敏感株和地克珠利耐药株及马杜拉霉素耐药株中的表达水平
4.4 讨论
第5章 qPCR检测EtSTP和EtASNA1在不同耐药株中的转录水平
5.1 引言
5.2 材料和方法
5.2.1 实验虫株和实验动物
5.2.2 实验试剂
5.2.3 实验仪器
5.2.4 不同浓度耐药株转录水平的研究
5.2.5 野生地克珠利耐药株转录水平的研究
5.2.6 药物作用后对EtSTP和EtASNA1转录水平的影响
5.3 结果
5.3.1 EtSTP和EtASNA1在不同浓度耐药株转录水平的比较
5.3.2 野生地克珠利耐药株中EtSTP和EtASNA1的mRNA转录水平的研究
5.3.3 体外培养观察药物作用虫体后对EtSTP和EtASNA1 mRNA转录水平的影响
5.3.4 体内试验观察药物作用虫体后对EtSTP和EtASNA1转录水平的影响
5.4 讨论
第6章 全文总结
参考文献
攻读学位期间取得的研究成果
致谢
本文编号：3854044
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