大豆半胱氨酸蛋白酶抑制剂基因在百脉根共生结瘤过程中的功能研究

发布时间：2025-04-01 06:32

　　根瘤是豆科植物将空气中氮气转化为自身可利用氮的关键器官。根瘤固氮对提高土壤肥力、增加农作物产量以及减少工业氮肥的使用具有重要意义。固氮根瘤的形成涉及一系列反应如根瘤菌早期的侵染和根瘤器官的发生以及结瘤过程根发育的协调等,然而豆科植物本身的共生结瘤机制尚未完全清楚。半胱氨酸蛋白酶抑制剂(cystatin,CYS)在结瘤,根瘤发育和衰老过程中起重要作用。本研究克隆了2个大豆半胱氨酸蛋白酶抑制剂基因GmCYS2和GmCYS20;通过体外蛋白酶活性抑制试验来揭示其生化功能;利用豆科模式植物百脉根作为载体,通过发根农杆菌介导的毛根转化技术在百脉根毛根中超量表达GmCYS2和GmCYS20基因,鉴定复合体百脉根共生结瘤表型来证实GmCYS2和GmCYS20基因在共生信号转导过程中的功能。研究生期间主要研究成果如下:1.克隆了2个大豆CYS家族基因GmCYS2和GmCYS20,氨基酸序列比对及进化树分析表明,GmCYS2与木豆(Cajanus cajan)CYS蛋白相似性高达73%。大豆GmCYS20蛋白与野生大豆(Glycine soja)CYS蛋白相似性高达99%。2.在大肠杆菌中表达和纯化GmC...

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【学位级别】：硕士

【部分图文】：

图3-1大豆GmCYS2与其他豆科植物同源蛋白的多序列比对

GmCYS2基因全长为393bp,克隆的基因序列与NCBI网站公布的GmCYS2基因序列完全吻合,该基因编码130个氨基酸残基,其中N端是26个氨基酸残基编码的信号肽组成。通过NCBI网站上的Blastp比对发现,该基因编码的蛋白序列与木豆、狭叶羽扇豆、绿豆、赤豆的CYS相....

图3-2大豆GmCYS20与其他豆科植物同源蛋白的进化树分析

通过DNAMAN软件得到与上述物种CYS蛋白的进化树,发现大豆GmCYS2蛋白与木豆的CYS蛋白关系最近,处在同一进化分支上且亲缘高达97%(图3-2)。3.1.2重组蛋白GmCYS2的表达、纯化和体外酶活检测

图3-3 His-GST-GmCYS2融合蛋白的序列

构建的重组蛋白序列如图3-3所示,包含双标签His-GST以及GmCYS2C端的104个氨基酸,其大小为40kDa左右。氨基酸第5-10位为His标签;14-233位为GST标签;244-250位为烟草蚀纹病毒(TEV)的切割位点;251-355位为GmCYS2蛋白序列(去掉....

图3-4 GmCYS2蛋白的体外表达、抗体检测和蛋白纯化

图3-4a,b中1和2泳道分别为两种条件下的全细胞裂解液,并且都检测到了GmCYS蛋白的表达。用超声波将全细胞裂解液破碎然后再离心,SDS-PAGE分析上清液和沉淀,发现在图3-4a,b中3和4泳道中,也就是15℃诱导16h条件中目的蛋白条带集中出现在沉淀中;37℃诱导4h条....

本文编号：4039068