黄花蒿中黄酮类化合物生物合成AaF3H和AaFLS基因克隆与功能鉴定

发布时间：2017-09-23 17:24

  本文关键词：黄花蒿中黄酮类化合物生物合成AaF3H和AaFLS基因克隆与功能鉴定

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【摘要】：黄花蒿(Artemisia annua L.)为一年生草本植物,其主要活性物质青蒿素已被世界卫生组织作为治疗疟疾的首推物质。但从2008年世界各地尤其是东南亚地区和非洲地区陆续报道了青蒿素耐药性的案例以来,青蒿素耐药性问题已成为全球关注的焦点。近年研究表明,黄花蒿中许多次生代谢产物具有协同增强青蒿素药效的功能,尤其是黄酮类化合物不仅是实现此协同效应的关键物质,而且还能够减缓疟原虫耐药性的进化并且阻止青蒿素耐药性的产生。然而当前相关研究主要集中于黄酮类化合物的生物活性和对青蒿素抗疟疾的协同增效作用等方面,而鲜见黄酮类化合物在黄花蒿中的生物合成途径等研究。为此,本研究在成功克隆黄花蒿中黄酮类化合物两个关键合成酶基因的基础上,对其在大肠杆菌E.Coli(BL21)DE3中的原核表达以及两个酶的体外纯化、酶活性和功能进行了系统研究,以期为后续黄花蒿中青蒿素与黄酮类化合物在生物合成途径、协同增效功能以及阻止青蒿素耐药性产生及发展等方面的关联研究提供参考。主要研究结果如下：1、以黄花蒿幼嫩芽叶为材料,提取总RNA,并逆转录得到cDNA,应用PCR技术克隆了黄花蒿中黄烷酮3-羟化酶(AaF3H)基因ORF,该序列包含一个完整的编码区1095 bp,编码364个氨基酸组成的蛋白。该蛋白的分子量为41.18 KDa,等电点为5.67。该AaF3H基因编码蛋白与银杏、拟南芥、茶树和柚子中的F3H编码蛋白相比,分别具有67%、76%、77%和78%的相似性。将AaF3H基因克隆到原核表达载体pET-28a,并采用原核表达的方式在大肠杆菌E.Coli (BL21) DE3中进行了融合表达。经IPTG诱导表达得到融合蛋白,重组大肠杆菌在IPTG终浓度为0.5mM、诱导温度28℃、诱导时间8h条件下表达效果较好。2、提取表达的AaF3H重组蛋白并利用Ni-NTA亲和柱色谱法对表达的重组蛋白进行纯化,通过体外酶促反应发现该重组蛋白具有转化(2S)-黄烷酮为(2R,3R)-二氢黄酮醇的羟基化能力,能够催化底物(2S)柚皮素转化为(2R,3R)-二氢山奈酚。酶学性质研究发现其反应最优pH为8.5,反应温度35℃,在此参数条件下AaF3H在体外具有最强的催化活性,以柚皮素为底物时Km为164.35μM。3、以黄花蒿幼嫩芽叶cDNA为原料,应用PCR技术克隆了黄花蒿中黄酮醇合酶(AaFLS)基因ORF,该序列包含一个完整的编码区1008 bp,编码335个氨基酸组成的蛋白,该蛋白的分子量为37.85KDa,等电点为5.32。该AaFLS基因编码蛋白与黑心金光菊、三花龙胆、烟草、马铃薯中的FLS编码蛋白相比,分别具有86%、74%、74%、73%的相似性。将AaFLS基因克隆到原核表达载体pET-28a,并采用原核表达的方式在大肠杆菌E.Coli (BL21) DE3中进行了融合表达。重组大肠杆菌在IPTG终浓度为0.5mM、诱导温度28℃、诱导时间8h条件下表达效果较好。4、提取表达的AaFLS蛋白并利用Ni-NTA亲和柱色谱法对表达的重组蛋白进行纯化,体外酶促反应发现该蛋白具有转化(2R,3R)-二氢黄酮醇为黄酮醇的能力,能催化底物(2R,3R)-二氢山奈酚转化为山奈酚,其酶促反应最优pH为7.5,反应温度23℃,在这此参数条件下,该酶具有最强的催化活性,以(2R,3R)-二氢山奈酚为底物时Km为127.49μM。
【关键词】：黄花蒿 黄酮类化合物 合成酶基因 基因克隆 功能鉴定
【学位授予单位】：湖南农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：Q943.2;S567.219
【目录】：

• 摘要4-6
• Abstract6-8
• 缩写词(Abbreviation)8-15
• 第一章 绪论15-25
• 1 黄花蒿青蒿素抗疟疾研究进展15-20
• 1.1 黄花蒿15-16
• 1.2 青蒿素抗疟疾作用16-17
• 1.2.1 青蒿素抗疟疾机制17
• 1.3 青蒿素其他作用17-18
• 1.4 青蒿素的耐药性18-20
• 2 黄花蒿黄酮类化合物研究进展20-24
• 2.1 黄花蒿黄酮类化合物及其生物活性20-21
• 2.2 黄花蒿黄酮类化合物协同青蒿素抗疟疾作用21-22
• 2.3 黄花蒿黄酮类化合物的生物合成22-24
• 2.3.1 黄烷酮3-羟化酶基因(F3H)22-23
• 2.3.2 黄酮醇合酶基因(FLS)23-24
• 3 研究目的与意义24
• 4 研究内容24-25
• 第二章 黄花蒿黄烷酮3-羟化酶(AaF3H)基因克隆及原核表达25-37
• 1 材料与方法25-31
• 1.1 材料25-27
• 1.1.1 黄花蒿原料25
• 1.1.2 主要仪器设备25-26
• 1.1.3 主要试剂26
• 1.1.4 溶液配制26-27
• 1.2 方法27-31
• 1.2.1 黄花蒿RNA的提取27
• 1.2.2 黄花蒿RNA逆转录27-28
• 1.2.3 AaF3H基因克隆28
• 1.2.4 AaF3H基因原核表达28-30
• 1.2.5 AaF3H重组蛋白分离纯化及浓缩30-31
• 1.2.6 AaF3H基因的核苷酸和氨基酸序列分析31
• 2 结果与分析31-37
• 2.1 黄花蒿RNA提取31
• 2.2 AaF3H基因的PCR克隆31-32
• 2.3 AaF3H基因原核表达32-34
• 2.3.1 AaF3H-T重组质粒菌落PCR检测32
• 2.3.2 AaF3H-T重组质粒双酶切32-33
• 2.3.3 AaF3H-pET28a重组质粒转化DH5α菌落PCR检测33
• 2.3.4 转化了AaF3H-pET28a重组质粒的BL21诱导表达体系SDS-PAGE检测33-34
• 2.4 AaF3H重组蛋白分离纯化及浓缩34-35
• 2.5 AaF3H基因的核苷酸和氨基酸序列分析35
• 2.6 小结35-36
• 2.7 讨论36-37
• 第三章 黄花蒿黄烷酮3-羟化酶(AaF3H)功能鉴定37-41
• 1 材料与方法37-38
• 1.1 材料37
• 1.1.1 酶原料37
• 1.1.2 主要仪器设备37
• 1.1.3 主要试剂37
• 1.2 方法37-38
• 1.2.1 AaF3H酶促反应体系37-38
• 1.2.2 柚皮素及反应产物液相检测38
• 1.2.3 AaF3H酶反应的最适pH实验38
• 1.2.4 AaF3H酶反应的最适温度实验38
• 1.2.5 AaF3H酶的Km米氏常数测定38
• 2 结果与分析38-41
• 2.1 AaF3H酶促反应38-39
• 2.2 AaF3H酶反应的最适pH39
• 2.3 AaF3H酶反应的最适温度39-40
• 2.4 小结40
• 2.5 讨论40-41
• 第四章 黄花蒿黄酮醇合酶(AaFLS)基因克隆及原核表达41-47
• 1 材料与方法41-42
• 1.1 材料41
• 1.2 方法41-42
• 1.2.1 AaFLS基因克隆41
• 1.2.2 AaFLS基因原核表达41
• 1.2.3 AaFLS重组蛋白分离纯化及浓缩41-42
• 1.2.4 AaFLS基因的核苷酸和氨基酸序列分析42
• 2 结果与分析42-47
• 2.1 AaFLS基因的PCR克隆42
• 2.2 AaFLS基因原核表达42-45
• 2.2.1 AaFLS-T重组质粒菌落PCR检测42-43
• 2.2.2 AaFLS-T重组质粒双酶切43
• 2.2.3 AaFLS-pET28a重组质粒转化DH5α菌落PCR检测43-44
• 2.2.4 转化了AaFLS-pET28a重组质粒的BL21诱导表达体系SDS-PAGE检测44-45
• 2.3 AaFLS重组蛋白分离纯化及浓缩45
• 2.4 AaFLS基因的核苷酸和氨基酸序列分析45
• 2.5 小结45-46
• 2.6 讨论46-47
• 第五章 黄花蒿黄酮醇合酶(AaFLS)酶的功能验证47-51
• 1 材料与方法47-48
• 1.1 材料47
• 1.1.1 酶原料47
• 1.1.2 主要仪器设备47
• 1.1.3 主要试剂47
• 1.2 方法47-48
• 1.2.0 AaFLS酶促反应体系底物制备47
• 1.2.1 AaFLS酶促反应体系47-48
• 1.2.2 二氢山奈酚及反应产物液相检测48
• 1.2.3 AaFLS酶促反应的最适pH实验48
• 1.2.4 AaFLS酶促反应的最适温度实验48
• 1.2.5 AaFLS酶的Km米氏常数测定48
• 2 结果与分析48-51
• 2.1 AaFLS酶促反应48-49
• 2.2 AaFLS酶反应的最适pH49
• 2.3 AaFLS酶反应的最适温度49-50
• 2.4 小结50
• 2.5 讨论50-51
• 第六章 研究结论,创新点及展望51-53
• 6.1 研究结论51-52
• 6.1.1 从黄花蒿cDNA中克隆了两个黄酮类化合物生物合成相关的(AaF3H和AaFLS)基因51
• 6.1.2 以原核表达方式在大肠杆菌E.Coli BL21(DE3)中表达了黄酮类化合物生物合成关键酶(AaF3H和AaFLS)并通过酶促活性反应对其功能进行了鉴定51-52
• 6.2 创新点52
• 6.3 研究展望52-53
• 参考文献53-63
• 致谢63-64
• 作者简介64-65

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