影响MP1和GMPR2基因在辽宁绒山羊皮肤中表达的研究

发布时间：2017-09-25 03:14

  本文关键词：影响MP1和GMPR2基因在辽宁绒山羊皮肤中表达的研究

  更多相关文章： MP1 GMPR2 FGF5 Noggin IGF-1 慢病毒

【摘要】：本实验旨在研究调控MP1与GMPR2基因在皮肤中表达的影响因素与机制,希望以此了解毛囊细胞的形成与周期发育,对进一步选育辽宁绒山羊提供建设性意见及帮助。首先制备Noggin基因的RNA干扰载体并且感染羊皮肤传代细胞,然后利用成纤维细胞生长因子和类胰岛素细胞生长因子与褪黑激素既单独又联合处理羊皮肤细胞,最后通过Thermal Cycler DiceTM System Software计算分析出MP1和GMPR2基因的相对表达量。实验结果如下:(1)慢病毒的最佳MOI值为30,并且需要添加polybrene助染剂增强感染效率。(2)成功构建Lenti-Noggin-EGFP-mi R慢病毒后,经过计算滴度为1.35×106Tu/ml。(3)GMPR2基因在Noggin干扰组的相对表达量最低,而在阴性对照组中最高。(4)褪黑激素处理羊成纤维细胞结果显示,MP1基因的表达被抑制,但随着药物处理时间的延长,抑制效果被削弱。(5)FGF5处理羊成纤维细胞时,MP1与GMPR2基因在分时段表达差异非常显著,其中24小时10-6g/L和48小时10-5g/L分别出现最大值。(6)IGF-1处理羊成纤维细胞,目的基因MP1随着药物处理时间延长,浓度降低,基因表达的抑制程度逐渐降低,而GMPR2基因在10-4g/L 72小时出现最大值。(7)协同实验证明褪黑激素与任何一种外源蛋白联合使用均可以促进两种基因的表达,其中与FGF5协同作用效果更显著。结论:(1)BMP信号通路负调控GMPR2基因的表达。(2)褪黑激素对FGF5具有正相关调控作用,协同使用可以促进两个目的基因的表达。这为进一步研究细胞因子与褪黑激素对目的基因表达的作用机制提供数据支持,以及对绒毛性状的影响提供理论基础。
【关键词】：MP1 GMPR2 FGF5 Noggin IGF-1 慢病毒
【学位授予单位】：辽宁师范大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S827
【目录】：

• 摘要3-4
• Abstract4-7
• 1.背景7-12
• 1.1 辽宁绒山羊的概述7
• 1.2 辽宁绒山羊基因的部分研究进展7-8
• 1.2.1 MAPK信号通路及支架蛋白7-8
• 1.2.2 鸟甘酸还原酶 28
• 1.3 基因表达的研究方法8-9
• 1.3.1 RNA干扰8-9
• 1.3.2 慢病毒(Lentiviral vectors)载体9
• 1.4 影响毛发生长的主要因素9-11
• 1.4.1 褪黑激素(Melatonin,MT)9-10
• 1.4.2 成纤维细胞因子（Fibroblast Growth Factor，FGF5）10
• 1.4.3 类胰岛素细胞因子（Insulinlike Growth Factor,IGF-1）10-11
• 1.5 研究目的及意义11-12
• 2.材料与方法12-22
• 2.1 材料12-13
• 2.2 方法13-22
• 2.2.1 辽宁绒山羊皮肤细胞培养13
• 2.2.2 摸索最佳MOI值13-14
• 2.2.3 Noggin基因干扰载体的构建14-17
• 2.2.4 Noggin基因干扰慢病毒的包装、收集和滴度测定17-18
• 2.2.5 慢病毒感染辽宁绒山羊皮肤细胞18-20
• 2.2.6 外源蛋白处理辽宁绒山羊皮肤细胞20-22
• 3. 结果22-40
• 3.1 细胞培养22-23
• 3.2 最佳MOI值23-24
• 3.3 Noggin基因干扰载体的构建与鉴定24-27
• 3.4 Noggin基因干扰慢病毒包装27-30
• 3.5 慢病毒感染辽宁绒山羊皮肤细胞30-32
• 3.6 MP1基因在辽宁绒山羊皮肤细胞中的表达32-36
• 3.7 GMPR2基因在皮肤中的表达分析36-40
• 4 讨论40-43
• 结论43-44
• 参考文献44-50
• 附录A 质粒抽提方法50-51
• 附录B goat ACTB内参基因、MP1和GMPR2基因曲线图51-52
• 附录C 病毒液感染后GMPR2的扩增曲线及溶解曲线52-53
• 附录D MP1基因在MT组荧光定量的扩增曲线及溶解曲线53-56
• 附录E MP1基因在FGF5组荧光定量的扩增曲线及溶解曲线56-59
• 附录F GMPR2基因在FGF5组荧光定量的扩增曲线及溶解曲线59-62
• 附录G MP1基因在IGF-1 组荧光定量的扩增曲线及溶解曲线62-65
• 附录H GMPR2基因在IGF-1 组荧光定量的扩增曲线及溶解曲线65-68
• 附录I 协同实验组的扩增曲线及溶解曲线68-70
• 致谢70

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本文编号：915033