铜绿假单胞菌蹭行运动和表面感知机制的研究

发布时间：2016-10-23 08:19

第一章绪论

多细胞生物是指由两个或两个以上分化细胞构成的生物体,如植物、动物、藻类和真菌都是多细胞生物。关于多细胞生物如何产生有着种种假说。共生理论(Symbiosistheory)认为多细胞生物是由多种不同功能的单细胞生物聚集之后偶然完成了生理协作而成,主要立足于对多细胞生物各功能分化部分的解释,但存在一系列的遗传学问题难以解决。群体学说(Colonialtheory)则认为多细胞生物先是由多个单细胞的同种生物聚集起来,或是单个细胞多次分裂后无法相互分离而聚集,之后细胞群体产生分化逐渐形成多细胞生物。以上假设都相对笼统,这一问题确实尚无定论,下面从几个方面展开讨论。首先,多细胞生物的第一持征并非是细胞聚集体,而是个体内部各个部分的高度分化和分工,任何单一部分都无法独立地完成对整体的重建。从这一点上可区分肿瘤及细菌生物膜与多细胞生物,因为肿瘤和生物膜的组成单元虽然可能由于所处相对位置不同而代谢活性有所区别,但单一的细胞个体取出后仍然可以生成新的肿瘤和生物膜,因此癌细胞和细菌都并非具有高度分化能力的个体,癌细胞是丧失了分化能力的细胞。第二,既然分化性对于多细胞生物如此重要,又从一般演化理论上说"存在即有优势",那么分化的优势是什么呢?这点可从人类社会分工的过程来理解。起初由于生产资料有限,人们靠打猎维持生活,人人只需要学会打猎。随着生产力的发展,各种生产方式如种植、畜牧、冶金相继出现,而商品交换直接推动了社会分工。大家为什么不去努为成为全才,把所有技能都学会呢?一是个体精力有限,很难学会所有的技能;二是就算学会的所有的技能也无法全部使用这些技能,因为每种技能都对应着一种生产工具,人们必须首先制备这些生产工具才能完成生产,存在很大的成本问题。

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第二章细菌谱行运动的高通量分析

2.1本章概述

早期,人们把细苗戳到琼脂板的底部,认为这种条件下细菌无法游动,只能依靠菌完成蹭行(图11(a))。由于拍照技术的限制,研究者只能得到画质较低的照片,通过测量细菌群落边界的大小来描述蹭行能为。近年来显微照相技术、在线细菌培养技术的快速发展使得对蹲行的原位观测成为可能,Gibiansky和Jin等人在高速显微镜下观察禄旅杆菌的蹭行过程,同时引入图像追踪算法对蹭行的行走和跳跃两种亚型进行了定量描述。Zhang等人在不同高度的高分子刷表面观察蹭行过程,发现高粘度表面跳跃频率明显升高[172]。然而,以上的观测都是针对蹭行运动局部性质的研究,欲理解蹭行的宏观规律需首先对其进行统计描述和定量分析。我们据此引入了一套自动化、图形化输出的蹭行分析方法,系统地描述细菌蹭行过程中运动速度、运动轨迹和转动情况,同时改变往的实验方以实现大量运动信息的高效采集,从而最终完成对蹭行运动的宏观统计描述。本章将从实验设计、蹲行视频采集、图像处理以及数据汇总分析和输出等方面详细阐述该一方法。

2.2绿賊杆菌在表面上蹭行运动数据的高通量获取

2.2.1细菌培养
我们在实验中使用的菌种为绿旅杆菌ATCC15692 fliM基因是为了消除细菌鞭毛对蹭行运动的干扰。首先从-80°C冰箱中取出冻存的菌种,在1.5%琼脂的LB培养板上划线,放在恒温培养箱中37°C解育18小时。待长出菌斑后,挑一个单克隆菌斑接种于1ml限制性培养基FAB+30mM谷氨酸,在37。200rpm转速下摇菌培养10小时。在对数期约00600 0.8左右收集细菌,按体积比1:1稀释到1ml新鲜的FAB中。

第三章细菌蹭行运动的多样性及环境响应性......79

3.1本章概述......79
3.2细菌蹭行运动的多样性及分类......79
3.3不同养料环境对细菌表面爬行行为的影响......85
第四章蹲行运动模型的建立及模拟......99
4.1本章概述......99
4.2运动模型的建立......99
4.3运动模型的计算机模拟......103
第五章铜绿假单胞菌表面感知机制的研究......117
5.1本章概述......117
5.2实验结果......119
5.3实验方法和步骤........126

第四章蹭行运动模型的建立及模拟

4.1本章概述

从第三章可知,在蹭行运动过程中细菌的运动速度和轨迹的平滑程度呈明显的正相关,而且贯穿始终的多样性是该过程最为明确不可回避的特征。怎样理解和解释这种正相关性以及多样性成为理解蹭行运动的关键,本章将围绕这一问题做仔细的探讨。我们首先尝试建立一个基于细菌胞内FimX蛋白分布的理论运动模型,阐述细菌运动速度和轨迹形状的关联性以及多样化运动产生的分子内因。该模型假设分布于细菌两极的菌毛相互竞争地将细茵拉向相反方向,而FimX的布决定两极菌毛的活跃程度。我们从已有的细菌运动数据中抽提出菌毛动作的统计数据,再按照蒙恃卡洛抽样模式的方法模式细菌在表面上的运动,通过对FimX表达量参数7和对称性参数片的调节,完全重现了细菌的多样性蹭行过程。然后,我们从保险假设的角度去理解蹭行运动保持多样性的演化内因。我们假设蹭行运动具有寻找资源和聚集成巧的两相功能,运动快的细菌在寻找新的资源、占有新的领地方面拥有优势,而运动慢的细菌更能在一个生长条件比较优越的环境中聚集,进而成为生命力更强的生物膜形式的存在。这样,多样性的运动提供了一个双保险,使细菌在漫长的演化史上很好地适应快速变化的外界环境。最后,我们仍然通过计算机模拟的方法,解析出不同7和片情况下细菌搜素养料和形成聚集体的能力,验证保险假设的猜想。

4.2运动模型的建立

铜绿假单胞菌单个细菌也包含多根菌毛,不同于淋球菌的是绿铜绿假单胞菌为长圆形,其菌毛并非周身分布,而是位于长轴的两端且均可拉动细菌。在菌毛的后方有两个极为关键的马达, PilB使菌毛蛋白单元PilA聚合伸出胞外,而PilT则将PilA解聚合使菌毛收缩。N1T和PilB均为ATP水解酶,通过消耗ATP得到能量,然后供给细菌运动。在PilB的后方则有PilZ和FimX,调节PilB的功能,第三章中已经证实FimX的胞内分布决定着蹭行运动的方向。

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第五章铜绿假单胞菌表面感知机制的研究

5.1本章概述

第一章中己经介绍,研究细菌的表面感知机制即是研究细菌梢附到表面后如何完成表型转变,从活跃游动的浮游状态变为生物膜的状志。或许有人认为表面感知或浮游态-表面态转变是一个伪命题,细菌粘附表面之后只是自然地生长、増多,最后堆在一起而己。然而,多项实验表明生物膜内细菌的表型确己发生明显改变。例如以hiteky等人用微阵列方法测量铜緑假单胞菌生物膜内部基因表达情况发现,虽然绝大多数基因表达水平基本不变,但有约1%的基因表达明显上升或下降;生物膜中的胞外聚合物干重所占比例通常很高,可见生物膜中细菌分泌多糖、胞外蛋白等的能力也强于浮游态细菌。那么,浮游态-表面态转变的具体过程是什么?这一问题包括两点:一是细菌通过哪套系统响应了哪种表面信号?二是响应外界信号后细菌经历哪种信号通路调节表型的转变?

5.2实验结果

Christen等在实验中将sensor克隆在质粒上并以tac启动子控制sensor的转录,在iptg诱导条件下观察FRET信号。以上方法在长时间的生物膜跟踪检测中遇到两个问题:一是中等浓度iptg诱导下各细菌之间sensor表达量不均匀,表达量太低的细菌数据分析噪音较大;二是质粒在细菌中的拷贝数不稳定,必须始终保持抗生素张力环境才能防止质粒丢失,而我们则希望尽量避免引入额外的条件。我们首先利用miniTn基因重组系统将sensor基因片段重组到铜绿假单胞菌基因组上的固定位置,并分别尝试用结构性后动子如lac、tac、PA10403以及人工合成的结构性启动子等控制sensor基因的转录,以此实现将sensor基因在细菌中以单拷贝的方式稳定表达。如图5.3所示为各启动子下sensor在细菌中表达的英光信号我们最终选择信噪比较好的PA10403-sensor系统进行后续实验。

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参考文献（略)

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本文编号：150071