番茄rin突变体胎萌的生理机制及rin在胎萌中的作用

发布时间：2016-11-09 16:36

1.引言

种子作为引种驯化的一个基本单位，在优良种质和特异基因的遗传以及保持方面起着不可替代的作用。对于大多数植物而言，种子萌发过程是指种子在植株上发育成熟并且脱离母体植株以后，于适宜的温度下吸收水分直至胚轴（胚根）突破种皮期间发生一系列生理生化变化的过程。同时，发育成熟并脱离母体植株以后的植物种子可以分为两种：具有休眠期和不具有休眠期。具有休眠特性的种子成熟以后在短时间内难以萌发（即所谓的休眠现象），只有经过物理（例如低温层积）或者化学（例如 GA 等化学药剂诱导）的方法打破其休眠状态之后，并给以适当的发芽条件（比如充足的水分，适宜的温度、光照、氧气等）才能萌发；另外，即使浅休眠或者不具有休眠特性的物种其种子能在植株上萌发的现象也是非常罕见的。但是像禾本科作物的玉米、小麦、水稻、高粱、燕麦等，以及豆科的大豆、菜豆等曾被报道过种子在植株上萌发的现象。另外还有松科（如乔松）、马鞭草科（海榄雌）、紫金牛科（如桐花树）、漆树科（芒果）、茄科（辣椒、茄子、番茄等）、十字花科（拟南芥、大白菜、油菜、甘蓝等）、葫芦科（黄瓜、西瓜、甜瓜、佛手瓜等）等也报道了种子提前萌发的现象。像这种种子在母体植株上经过一定程度的发育以后在脱离母体植株以前即萌发的现象被叫做胎生或者胎萌。这是作物的一种品种特性，并受外界环境条件的影响。

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2 材料与方法

2.1 试验材料

LA0617（ABA-缺失型突变体）：由美国戴维斯番茄种质资源中心（TGRC）提供，也叫萎蔫型突变体；LA2895（GA-缺失型突变体）：由美国戴维斯番茄种质资源中心（TGRC）提供，植株深绿色，矮化；番茄 rin 突变体:由东北农业大学番茄研究所提供，含有成熟抑制基因（rin），大花萼、果实表现迟熟性状，种子具有胎萌特性；对照品种 :由东北农业大学番茄研究所提供, 果实各发育阶段特征明显，种子无过早萌发的特点。生化试剂：ABA(美国 sigma)、聚乙二醇 6000(天津博迪化工公司)、 CaCl2•2H2O(天津华鑫试剂公司)试剂盒：cDNA 第一链合成试剂盒、T easy-Vector、Plant easy RNA 提取试剂(均购自北京全式金生物技术有限公司)；质粒提取试剂盒、胶回收试剂盒(均购自上海生工)；载体及菌株：E.coli DH5α、农杆菌 EHA105、PBI121、pTCK303 由本实验室保存

2.2 试验方法

在开花期，对番茄 rin 突变体的花序进行挂牌标记。根据连续几年对胎萌现象发生规律的调查，将番茄开花授粉之后 30、35、40 天，无任何病虫害、发育良好的果实切开，观察有无种子发生胎萌并进行记录；而对于开花授粉之后 45、50、55 天的番茄果实，挑选无任何病虫害、发育良好、种子发生胎萌的番茄果实剥开，，将果实里的种子用镊子小心剥离出来，统计已经胎萌和未胎萌的种子数目，计算这三个发育阶段的果实内种子的萌发率。（每个阶段的果实取 5 个，三次重复，用 Duncan 统计计算萌发率）。采收部分开花授粉之后 55 天的果实，置于常温下一段时间，或者将开花授粉之后 55 天的果实进行特殊标记留于植株上一段时间，观察调查统计其果实内种子胎萌的数目。

3 结果与分析 .................... 31 

3.1 番茄 rin 突变体生理特性分析 .............. 31
3.2 番茄 rin 突变体 rin 的扩增、载体构建及转化......... 40
4.讨论 ........................ 50 
4.1 番茄果实组织对种子胎萌的抑制作用.......... 50
4.2 激素缺失（ABA）对种子休眠和萌发的影响................... 50
4.3 番茄 rin 突变体种子胎萌的原因分析.................. 51
4.4 转录因子 LeMADS-rin 在 rin 突变体种子胎萌中的角色............ 52
4.5 工作展望 ..................... 53
4.6 创新点 .............. 54
5 结论............... 55 

4.讨论

4.1 番茄果实组织对种子胎萌的抑制作用

一般而言，像茄科的番茄、茄子、辣椒及葫芦科的西甜瓜，其发育中的种子在果实内难以萌发，但是当把番茄种子从果实内取出，去掉种子表面的胶黏物质并置于水中孵育时，种子均能正常萌发[133]，本试验的结果也证明了此结论；且随着种子成熟度的增加，其萌发率越来越高。这表明番茄果实组织能够抑制发育中的种子在果实内的萌发，此结论也与 Welbaum和 Bradford 对甜瓜种子的研究结论相一致，即果实组织对种子的早熟萌发（胎萌）具有制作用，并且果实组织内相对高的渗透势会影响种子在果实内的萌发趋势[44,72,74]。根据番茄 rin 突变体胎萌现象的跟踪调查发现其发育中的种子在果实内的萌发最早发生在开花授粉之后 45 天左右的部分果实内，此时只有零星几个种子在果实内萌发，大部种子的萌发被抑制住；随着果实的继续发育，种子在果实内萌发的数量越来越多，胎萌趋势越来越明显。这可能与番茄果实环境的变化（本试验中体现为果实内渗透摩尔浓度）有一定的相关性。并且番茄果实除了提供抑制种子在果实内萌发的渗透环境，果实组织内也含有与种子休眠和萌发密切相关的植物激素，即 ABA。

4.2 激素缺失（ABA）对种子休眠和萌发的影响

休眠是种子在进化过程中发展起来的一种适应性特征，它是种子渡过恶劣环境、选择合适的气候条件以及栖居地、繁衍下一代的保证。有的种子在休眠过程中继续发育完成其后熟进程，为下一代种子萌发做好准备。对种子休眠类型的研究以及为打破休眠、降低其休眠程度所作的种种尝试都极大的提高了种子的萌发率，例如通过沙藏处理、机械摩擦以及硫酸浸泡等打破由种皮引起的外休眠；通过喷施外源 GA、冷藏与 PEG 的结合破除由胚引起的内休眠等[133]。休眠现象的产生受到大量遗传因素与环境因子的影响，根据引起休眠的原因或者休眠程度可以分为初生休眠（primary dormancy）和次级休眠（secondary dormancy）。初生休眠是由于胚的休眠而引起的，此类休眠的种子即使提供适宜的环境条件也不能萌发；而次级休眠是指由于环境条件不适而引起的种子被迫休眠。种子的休眠与种子或者母体植株内ABA的含量或者种子各部分结构对 ABA 的敏感性存在着很强的关联性。
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5 结论

本试验从番茄果实和种子的发育特点入手，研究了番茄 rin 突变体种子早熟萌发现象的生理机制；并对 LeMADS-rin 进行了扩增、分析及转化，主要结论如下：（1）总结了番茄 rin 突变体种子胎萌发生的规律。番茄 rin 突变体在开花授粉之后 45 天左右时，部分果实内的种子开始萌发，随着果实和种子继续发育，果实内萌发的种子胚根伸长，萌发种子数逐渐增多。到开花授粉之后 55 天时，胎萌种子所占的比例由最初的 7%增至15%左右。如果到采收阶段，果实仍然保留在母体植株上或者采收后置于常温下一段时间，胎萌种子继续增多，比例能达到 45%左右。并且此时，果实内种子周围的胶原物质被消耗殆尽，出现小的空腔。（2）番茄果实组织对种子在果实内的萌发具有抑制作用。将正在发育中的番茄种子每隔特定时间段取出，并去掉种子周围包裹的胶原物质，置于水中孵育 7 天，各发育阶段的种子均表现出相应的萌发能力并呈现出不同的萌发率；将发育中的种子重新放回果实胶原物质中离体培养时，种子萌发受到抑制；当这些不能萌发的种子重新置于水中时，又恢复相应的萌发能力。这表明番茄果实组织对未熟种子的萌发具有抑制作用。

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参考文献（略）

本文编号：169267