猪场环境土壤中氟苯尼考耐药基因污染的研究

发布时间：2016-11-09 16:38

第一章绪论

目前,大部分抗生素被用于兽医领域来增加养殖场的产量。据统计,在美国食品动物的抗生素供给量大约是人用抗生素的4倍。多种抗生素都是动物食品及人医临床通用的,因此会增加人畜共患的耐药菌感染疾病出现的频率和传播风险。通过药物在动物体内药动学和特殊的转化进程,超过50%上的药物通常会以母体或者仍具有活性的代谢物形式排出体外有研究报道,口服嚼旋后10天采集粪便仍有超过96%的药物以药物原型或者代谢物的形式排出。在动物粪肥中,抗生素的浓度通常比较稳定或者因为代谢物被重新转化成药物原型而增加,这些含有島浓度的抗生素及仍具有生物活性的代谢物会通过施肥灌概的形式直接进入农田,如图1-6所示。这些残留的药物根据其自身的特性在环境中降解的时间也不同,有的可以在土壤环境存在几个月甚至几十年。这些物质不仅会对细菌菌群结构产生一定影响,还能促进耐药基因及可转移元件在环境菌株中的传播。

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第二章猪场环境土壤中氟苯尼考耐药基因污染水平的研究

2.1前言

随着抗生素的广泛使用,越来越多携带抗生素耐药基因的茵株被相继报道,这些耐药菌的出现也大大增加了抗生素对细菌感染性疾病治疗的难度。土壤作为一个公认的耐药基因储存库,多种耐药基因及耐药菌在土壤中被检出。许多研究也表明抗生素与耐药菌、耐药基因会以粪肥的形式由动物体内进入土壤环境中,并且会随着灌概时间的增长耐药基因的丰度会随之增加。如Fang等研究者对使用粪肥所灌概的农田土壤中耐药基因及抗生素污染水平进行研究,这些粪肥用来源于长期使用抗生素的窝类动物,发现灌概年限越长土壤中抗生素及耐药基因。这些土壤中的耐药基因及耐药菌很可能通过人类直接接触或以食物链的形式进入到人体,进而通过人类活动传播到更为广泛的环境中去,造成不可按制的局面。氟苯尼为第三类胺醇类兽医专用抗菌药,自1990年批准上市来广泛用于食源性动物的呼吸道疾病及肠道疾病的防治,然而大量的使用导致许多细菌获得了FFC药性。从2016年至今已发现6种特异性耐药基因,包括外排累基因如,不仅可异丙胺醇类抗生素产生耐药,还同时介导林可胺类、短侧耳素类、链阳菌素A类等其他4类结构各异的抗生素耐药。

2.2材料与方法

使用表2-2中的目的基因引物进行PCR扩增,1个浓度添加3个平化扩增体系如表2-5所示,体系为20,上下颠倒混匀后使用手掌离心机短暂离心30s。荧光定量PCR反应程序见表2-6。每个反应管内的荧光信号到达设定的瞬值时所经历的循环数)为横坐标X,起始模板拷贝数的却数为纵坐标Y,这两者之间存在线性关系,利用PCR反应得到的Ct值和已知的起始模板拷贝数的对数制作标准曲线。而溶解曲线是指定量PCR反应结束之后让样品继续升温直到PCR产物的双链全部打开,这时由于双链打开,荧光染料不发荧光,这样荧光值会有一个陡然的突降,借以检测PCR产物的特异性,相当于进行电泳检测。因为不同的PCR产物片段其TM值不同,单一的双链DNA其荧光陡降的温度一致,如果含有非特异性扩增产物,那么其萊光陡降的温度不止一个(两个或者更多),说明PCR引物特异性不够,需要重新设计引物进行标准曲线的制作。如洛解曲线出现单峰则说明引物特异性良化可用于定量检测。��

第三章猪场环境土壤中细菌多样性分析及宏基因组测序研究..........40

3.1前言.........40
3.2材料与方法.........40
3.3结果与分析.........48
3.4讨论.........60
3.5小结.........64

第四章宏基因组文库构建筛选猪场环境土壤中氟苯尼耐药基因的研究.........66

4.1前言.........66

4.2材料与方法.........66
4.3结果与分析.........81
4.4讨论.........89
4.5小结.........92
第五章结论.........94

第四章宏基因组文库构建筛选猪场环境土壤中氟苯尼考耐药基因的研究

4.1前言

自1990年FFC作为畜禽专用的胺醇类抗生素被批准上市以来,其耐药基因已在葡萄球菌、大肠杆菌、芽抱杆菌、麻球菌、变形杆菌、假单胞菌等多种常见的可培养细菌中发现。但目前不可培养的细菌微生物才是地球生物多样性的重要组成部分,自然生态环境中仅有不到1%的微生物可通过实验室培养的方式获得而进行相关研究。以往对于FFC耐药基因的研究通常都是通过抗性平板筛选耐药菌的方法进行,这种方法只能对极少部分可培养的细菌进行深入研究。功能宏基因组学是二十世纪末诞生的一项重耍应用学科,可以利用宏基因组文库的构建、高通量测序等技术,绕过传统的细菌培养环节,直接从环境样品总微生物DNA中筛选已知和未被发现的功能性基因。近几年,已有多种已知或未知的氨基糖类及四环素类等耐药基因通过构建土壤宏基因组文库被发现。目前为止,FFC耐药基因正是通过构建fosmid文库及抗性筛选的方法在阿拉斯加州的小岛土壤中被发现。在国内,近几年越来越多的FFC特异性耐药基因(包括外排聚基因及多重耐药基因、不断在猪源细菌中被发现,不过均是通过可培养方法获得鼻拭子或肛拭子中的耐药菌株后所进行的研究,而对于构建宏基因组文库直接筛选样品中FFC耐药基因的相关报道甚少,故本研究通过两种方法构建功能宏基因组文库对猪场环境土壤中的FFC耐药基因进行筛选,试图通过文库的抗性筛选挖掘土壤微生物中的已知或未知的耐药基因,为今后对微生物中耐药基因的研究提供方法借鉴。

4.2材料与方法

以大肠杆菌ATCC25922标准菌株作为质控菌,按美国临床实验室标准委员会(CLSI)推荐的肉汤微量稀释法进行。以宿主菌EPI300-T1R作为对照箇株,对文库中筛选得到的所有氟苯尼考抗性菌株测定其对氟苯尼考的MIC值。按照倍比稀释法,先在96孔细胞培养板中加入100阵MH肉汤;再将抗菌药物原液用MH肉汤稀释到512ng/L,加100阵至96孔细胞培养板第1孔中,依次对前10个孔进行倍比稀释,使得第1孔的浓度为256ng/曲。然后用MH肉汤将测试菌株稀释成l005CFU/mL,在每排前10孔各加入稀释菌液100阵,使得第1孔的药物浓度为128ng/L。第11孔加l00uL稀释菌液作为菌液对照,第12孔加100阵MH肉汤作阴性对照,37度恒温培养箱培养16~2化后,观察各孔细菌生长情况,抑制细菌生长的最高浓度即为各个菌株的氟苯尼考最小抑菌浓度(MIC),每个转化子做2个平行。对于药敏试验的判断结果,以CLSI发布的M31-A3为标准,质控菌ATCC25922对氟苯尼考MIC值范围在2 g/mL即为可信,而目前还没有关于其大厥杆菌对于氟苯尼考MIC值的判定标准,因此我们根据与宿主菌株对氟苯尼考的MIC值相比来判断转化子是否对氟苯尼考具有耐药表型。

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第五章结论

荧光定量PCR研究结果表明,6个猪场土壤中均呈现不同程度的FRGs污染,尤其是目前所发现的两种抗生素可转移的耐药基因,其中optrA基因在所有猪场土壤中均被检出,这是继2015年optrA基因在肠球菌中发现以来,首次在环境样品中检测到该基因的存在。通过荧光定量结果发现所有猪场土壤样品中均存在一定程度FRGs污染,而空白土壤未检测到任何FRGs的存在。另外,从相关性分析结果发现FRGs的整体水平随猪场FFC使用年限及年均使用量的增加呈升高趋势,推测FFC在猪场的使用会造成FRGs在周边环境菌中的流行,尤其是在人医临床上也受到广泛关注的FFC基因。

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参考文献（略）

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本文编号：169279