高抗氧化活性酒酒球菌的筛选及提升葡萄酒品质的研究
第一章 文献综述
1.1.1 乳酸菌简介
乳酸菌（lactic acid bacteria, LAB）广泛存在于自然界中，它是一类可发酵糖类并且代谢产生乳酸、无芽孢、革兰氏阳性细菌的统称。早在远古时期，人类就在食品加工或者酿造过程中不自觉的应用了乳酸菌。随着微生物学研究的不断深入，人们逐渐认识和掌握了乳酸菌的特性，并越来越广泛的将其应用于人类的生产和生活中。除少数致病菌外，绝大多数乳酸菌被公认为益生菌（Probiotics）。益生菌源于希腊语“对生命有益的细菌”，是一类对宿主有益、定植于宿主肠道和生殖系统内，可通过产生确切健康功效和发挥有益作用来改善宿主体内微生态平衡的有益微生物的总称。自 90 年代初以来，益生菌受到非常广泛的关注。目前，益生菌被应用于生物工程、工农业、食品安全以及生命健康领域。形形色色的“益生菌”类保健品已经风靡了全世界。
1.1.2 益生菌的研究进展
随着益生菌研究的不断深入，关于“益生菌”的定义出现了很多的争议。最近的研究发现，益生菌的健康功效具有菌株依赖性，并非属于乳杆菌属（Lactobacillus spp.）和双歧杆菌属（Bifidobacterium spp.）的菌株都具有益生作用（Zanoni et al. 2008）。此外，死菌、细菌代谢物或者细菌性的衍生物都能提供保健作用（Prisciandaro et al. 2009），这些物质也被研究者定义为“益生菌”。Argyri 等人（2013）认为，益生菌在胃肠道（Gastrointestinal tract, GIT）的定植能力不会影响他们对宿主健康功效的发挥。另外，不同来源的益生菌的保健功效是否有所差异呢？这一问题还有待于探讨（Foligné et al.2010）。益生菌普遍存在于人体和动物的肠道中，也存在于发酵的食品中。目前，属于乳杆菌属和双歧杆菌属且具有益生性能的 LAB 菌株大多都是从人体肠道中分离出来的（Kullisaar et al. 2002; Lin and Yen 1999; Mikelsaar and Zilmer 2009; Spyropoulos et al.2011; Zanoni et al. 2008）。然而，最近的研究发现来源于非土著微生物或者极端微生物的乳酸菌也能向宿主提供特殊的健康功效，这可能是因为这些微生物和其它乳酸菌都有着类似的结构特性或者功能特性（Foligné et al. 2010）。
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1.2.1 苹果酸-乳酸发酵
苹-乳发酵影响了葡萄酒的品质，葡萄酒经过苹-乳发酵后，葡萄酒中的化学物质、香气物质、颜色和感官性能均发生改变。酒酒球菌是启动苹-乳发酵发酵的主要微生物，它主要起到三个方面的作用：第一，降解苹果酸。L-苹果酸在酒酒球菌苹果酸乳酸酶的作用下转化为L-乳酸和CO2，并最终影响了葡萄酒的pH。第二，增加葡萄酒的微生物稳定性。第三，改变葡萄酒的感官品质，包括葡萄的风味、颜色和口感等（Versari et al. 1999; Costello et al. 2012）。
1.2.2 影响苹果酸-乳酸发酵的因素
苹-乳发酵过程受到乳酸菌菌株、葡萄品种、酿造工艺等的影响（Costello et al. 2012）。最近的研究发现，苹-乳发酵前葡萄酒的 pH 和乙醇浓度也是非常重要的影响因素，这是因为葡萄酒乳酸菌的碳水化合物代谢受到 pH 的影响（Liu et al. 1995），而不同的酒酒球菌菌株对乙醇的耐受性不同，从而影响了发酵后的葡萄酒中化学物质、芳香挥发物、风味、口感和颜色（Costello et al. 2012; Knoll et al. 2011）。
1.2.3 苹果酸-乳酸发酵对葡萄酒化学物质的影响
苹-乳发酵改变了葡萄酒的挥发性成分，包括酯类、高级醇、脂肪酸、萜烯类和内酯类物质等（Avedovech et al. 1992; Boido et al. 2009; D’Incecco et al. 2004; du Plessis et al.2002; Herjavec et al. 2001; Izquierdo Ca as et al. 2008; Knoll et al. 2011; Laurent et al. 1994;Lee et al. 2010; López et al. 2011; Malherbe et al. 2012; Maicas et al. 1999; Pozo-Bayón et al.2005; Sumby et al. 2010; Ugliano and Moio 2005）。葡萄酒的中的乳酸菌能够影响白葡萄酒（Avedovech et al. 1992; Herjavec et al. 2001; Knoll et al. 2011; Laurent et al. 1994）和红葡萄酒（Boido et al. 2009; Izquierdo Ca as et al. 2008; Lee et al. 2010; Maicas et al. 1999;Malherbe et al. 2012; Pozo-Bayón et al. 2005; Ugliano and Moio 2005）中挥发性物质的组成和含量。最近的研究发现，不同的菌株对葡萄酒中挥发性物质如酯类物质的影响不同（Sumby et al. 2010）。Delaquis 等人（2000）认为苹-乳发酵后，葡萄酒的芳香和风味的改变是由于乳酸菌和酵母代谢产物之间复杂的交互作用引起的。
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第二章 高抗氧化活性酒酒球菌的筛选及其特性研究
食品微生物的益生特性受到研究者越来越广泛的关注。最近的研究发现葡萄酒中的乳酸菌如酒酒球菌也具有益生特性，例如 O. oeni IOEB 9115 菌株就具有免疫调节性能和抗炎性能，，它能够缓解体内结肠炎症状并降低结肠炎损伤（Foligné et al. 2010）。O. oeniX2L 和 m1 菌株均具有蛋白质水解能力，它们可以将葡萄酒中的蛋白转化成具有抗氧化和抗高血压能力的多肽（Apud et al. 2013a; Aredes Fernández et al. 2011; Manca de Nadraet al. 2007）。若使用 O. oeni m1 和 X2L 菌株进行苹-乳发酵，能够增加所酿造葡萄酒的抗氧化和抗高血压的性能（Apud et al. 2013a, 2013b; Aredes Fernández et al. 2011）。许多的乳酸菌像乳杆菌和双歧杆菌被证明具有体外和体内抗氧化能力（Amaretti et al. 2013;Lin and Yen 1999; Mikelsaar and Zilmer 2009; Songisepp et al. 2005; Spyropoulos et al.2011; Zanoni et al. 2008）。然而，目前对于酒酒球菌抗氧化活性的研究报道还很有限。因此，本研究利用不同的抗氧化评价方法对 20 株酒酒球菌和 1 株对照菌株的体外抗氧化性能进行测定和分析。
随着人们对人体健康、肠道微生物和益生菌之间联系的不断探索，益生菌对人体胃肠道有益的保健功能引起了研究人员广泛的关注。虽然研究者们对益生菌的定义有很多的争议，但是大多数研究者认为益生菌进入到人体胃肠道后才能发挥其潜在的益生功效，因此它们必须能够耐胃肠道严酷的生存环境。影响益生菌在胃肠道存活的因素有很多，如胃液的 pH 值、胆盐的浓度、停留的时间等（Bezkorovainy 2001）。人体消化道中所分泌的胃液的低酸性环境阻止了大多数微生物进入肠道。根据人们饮食结构的不同，胃液pH 值不断发生变化，通常其 pH 值在 3 左右；当食用酸性食品时，胃液 pH 值可达到 1.5左右；当食用碱性食品时，胃液 pH 值约在 4～5 之间。因此，具有较强的耐酸和耐胆盐特性成为筛选益生菌的先决条件。另外，当益生菌进入人体肠道后，其对肠道上皮细胞的粘附作用影响了它们在人体肠道内的定植及繁殖，这对其保健作用的发挥同样有着重要影响。因此，益生菌在肠道中的粘附能力也是筛选益生菌的重要指标之一。研究发现，益生菌在粘附细胞单分子层的同时会表现出疏水特性，这种细胞表面的疏水性与其粘附特性之间存在密切的联系。最近几年，细菌表面疏水性常常被用来评估细菌的粘附能力（Maldonado et al. 2012; Shakirova et al. 2013; Zago et al. 2011）。为了了解酒酒球菌的生理特性，本章对酒酒球菌在模拟胃肠液中的耐受性以及其体外疏水特性进行了研究。
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2.2.1 菌株
酒酒球菌菌株：HB-1a、SD-1c、SD-2gh、SD-1a、SD-2kj、SX-1a、SD-1g、HB-2b、SD-2d、SX-1b、SD-2gf、HB-1b、HB-1c、SD-2ji、SD-1f、SD-2b、SD-1e、SD-2ee 和SD-2a。这些菌株来自前期筛选并已进行了鉴定（Li et al. 2006; 王华等 2010）。O. oeni31-DH（O. oeni CICC 6066）和保加利亚乳杆菌（Lactobacillus bulgaricus）CICC 6032由中国工业微生物菌种保藏管理中心（China Center of Industrial Culture Collection, CICC）提供。
2.2.2 培养基与培养条件
ATB 液体培养基（赵文英，2008）：10 g/L 葡萄糖、10 g/L 蛋白胨、5 g/L 酵母浸粉、0.2 g/L MgSO4·7H2O、0.05 g/L MnSO4·4H2O、0.5 g/L L-半胱氨酸盐酸盐、25%番茄汁（v/v），蒸馏水配制。调节溶液 pH 值至 4.8，121℃高压蒸汽灭菌 20 min。将冷冻保藏的 O. oeni SD-2a 菌液转接至 ATB 液体培养基中，25℃静置培养。以 2%的接种量转接到新鲜液体培养基中进行活化培养。L. bulgaricus 在添加 0.05% L-半胱氨酸盐酸盐的 MRS 液体培养基中进行活化，37℃静置培养。
2.2.3 试剂
铁氰化钾、三氯乙酸（TCA）、硫代巴比妥酸（TBA）、丁基化羟基甲苯（BHT）、亚硝酸钠、对氨基苯磺酸、硫酸亚铁、抗坏血酸、L-半胱氨酸盐酸盐、亚油酸、氯仿、邻菲罗啉等试剂均为国产分析纯。羟自由基测试试剂盒、抑制与产生超氧阴离子自由基测定试剂盒、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）测定试剂盒、谷胱甘肽还原酶（GR）测定试剂盒、总谷胱甘肽（T-GSH）/氧化型谷胱甘肽（GSSG）测定试剂盒都购买自南京建成生物工程研究所。
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3.1 引言...................................................... 35
3.2 材料与仪器................................................. 35
第四章 还原型谷胱甘肽对品丽珠葡萄酒品质的影响.................59
4.1 引言........................................................ 59
4.2 材料与仪器....................................................... 59
第五章 经预适应性培养的酒酒球菌 SD-2a 对品丽珠葡萄酒品质的影响.....85
5.1 引言............................................................ 85
5.2 材料与仪器....................................................... 85
第六章 苹果酸-乳酸发酵过程中酒酒球菌不同基因的表达情况
第四章的研究发现葡萄酒进行苹-乳发酵前添加一定浓度的 GSH 有利于葡萄酒的品质；第五章的研究发现 GSH 促进了酒酒球菌的生长，经预适应性培养（含 GSH 的培养基）的 O. oeni SD-2a 更有利于葡萄酒的品质。为了进一步弄清楚上述环境中与 O. oeniSD-2a 代谢相关基因和胁迫适应性相关基因表达的情况。因此，本研究以 O. oeni SD-2a为发酵剂，在添加了 GSH 的模拟葡萄酒中进行苹-乳发酵；同时将经不同适应性培养的O. oeni SD-2a 接种于模拟葡萄酒中进行苹-乳发酵。然后对不同模拟葡萄酒环境中 O. oeniSD-2a 的生长情况和降解苹果酸的情况进行了分析，并研究了不同发酵时期 O. oeniSD-2a 中 2 种与代谢相关基因（mleA、citE）以及 8 种与酒酒球菌胁迫适应性相关基因（hsp18、clpP、clpX、ctsR、gsh、trxA、cfa、rmlB）的转录表达特性。
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6.2.1 试验菌株
菌株：O. oeni SD-2a。按照表 6-1 进行菌株的培养和在模拟葡萄酒培养基中接种。
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第七章 结论、创新点与展望
本论文评估了酒酒球菌作为益生菌的潜力，筛选出了具有高抗氧化活性的酒酒球菌；研究了具有较高抗氧化性能的酒酒球菌单独作用或和 GSH 共同作用时对苹-乳发酵后的葡萄酒品质的影响；筛选出了酒酒球菌在接种前进行预适应性培养的最佳方式，并评估了该培养方式获得的菌株对苹-乳发酵后的葡萄酒品质的影响。主要结论如下：
（1）本研究初步证明了酒酒球菌在体外抗氧化方面的有效性，将来仍需要通过体外和体内试验来研究酒酒球菌包括其抗氧化性能在内的益生性能及其可能的应用范畴。与酒酒球菌抗氧化性能有关的多重机制、相关的基因及防御系统仍需要进一步的研究。
（2）GSH 具有促进酒酒球菌生长的作用。然而目前就其作用机制方面仍需深入研究。如探讨谷胱甘肽在酒酒球菌抵抗酸或/和乙醇胁迫中酒酒球菌基因转录组的变化。
（3）将来需要对葡萄酒苹-乳发酵过程中 GSH 的添加时间和添加剂量以及 GSH 对苹-乳发酵阶段、陈酿阶段葡萄酒品质的影响等方面进行研究。
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参考文献（略）
本文编号：239568
本文链接：https://www.wllwen.com/wenshubaike/caipu/239568.html
