三种重要传染病病原体重组酶扩增检测技术的建立与应用

发布时间：2017-05-16 06:40

前 言

21 世纪以来，传染病仍然是危害人类生命健康安全的最大威胁之一，全球每年死亡人数中有 1/4 是死于传染病，新发、突发传染病逐年增多。如在我国爆发的急性重症呼吸综合征（SevereAcute Respiratory Syndrome，SARS），仅在 2002年 11 月至 2003 年 7 月间就造成了 8096 人感染，744 人死亡，病死率高达 9.6%[1]，直接导致我国经济损失达 933 亿元人民币[2]。还有 2009 年在墨西哥爆发的 H1N1流感疫情，短时间内在全世界迅速传播，据 WHO 提供信息，截至 2009 年 8 月6 日，全球累计报告甲型 H1N1 确诊病例已超过 17 万例[3]。距离我们更近的 2014年，西非爆发了灾难性的埃博拉疫情，截至 2015 年 7 月 19 日，死亡人数达 11284人，感染人数达 27741[1]。这些不断出现的重大传染病疫情给病原微生物的检测和疾病的诊断提出了更高的要求。因此，研究和发展快速、特异、灵敏、高效并且简便的现场诊断技术，对传染病的治疗和预防具有重要意义。
1、传染病诊断方法
自 PCR 创建以来，基于 PCR 原理的各种核酸扩增技术相继出现，并不断发展完善，如逆转录 PCR（RT-PCR）[5]、实时定量 PCR（real-time PCR）[6]、多重 PCR（multiplex PCR）[7]、巢式 PCR（nested PCR）[8]等等，为病原微生物检测带来突破性发展。然而无论是常规 PCR，还是 Real-Time PCR 都不可避免的要经历变性、退火、延伸等热循环步骤，需要具备精密昂贵的 PCR 扩增仪器才能实现核酸扩增，这些设备无疑限制了其在基层单位以及现场简陋条件下的应用，加之扩增时间长，成本高，使这些技术不适合传染病的现场检测和床旁诊断。因此，恒温核酸扩增技术应运而生。恒温核酸扩增是指在温度不变的情况下实现核酸扩增。在 20 世纪 90 年代，继 PCR 后，各种恒温核酸扩增技术陆续发展起来。主要的核酸恒温扩增技术包括依赖于核酸恒温扩增技术（Nucleic AcidSequence-BasedAmplification ，NABSA）滚环恒温核酸扩增技术（Rolling CircleAmplification，RCA）、解链酶依赖的恒温核酸扩增技术（Helicase-DependentAmplification ，HDA）、环介导的恒温核酸扩增技术（Loop-mediated isothermalAmplification，LAMP）、链置换扩增技术（Strand Displacement Amplification，SDA）、重组酶介导的恒温核酸扩增技术（Recombinase Polymerase AmplificationRPA）。与传统的常规 PCR 技术相比，等温核酸扩增摆脱了笨重的 PCR 仪器，并且可以在短时间内得到准确结果。

NASBA 技术[9]是在 1991 年由 Compton J.发明的基于转录依赖的恒温扩增技术。NASBA 反应需要两条引物和三种功能性酶，包括逆转录酶、RNase H、RNA 聚合酶，可在在恒温 41~42℃条件下进行，1.5~2h 即可将模板扩增 109~1010。结果判读可以通过琼脂糖凝胶电泳、荧光探针检测等来实现。该种方法特异性和敏感性较好，但是反应成分复杂，所需酶价格昂贵，RNA 目的片段长度受限且结果判读仍需要繁杂的后续实验操作。已有文献报道显示，该技术已用于 HIV病毒[10]、肝炎病毒[11]和巨细胞病毒[12]检测。链置换扩增技术（SDA）[13]是 Walker.G.T.等人在 1992 年发明的一种体外核酸等温扩增技术。该反应体系主要包括 4 条引物、限制性内切酶、 DNA 聚合酶等，其基本原理是利用不具备外切酶活性的 DNA 聚合酶，在限制性内切酶的辅助下，对单链 DNA 模板进行链置换的循环反应过程，在 37-40℃条件下 2h 内可完成模板 107扩增[15]。其结果判读主要通过与荧光偏振等技术结合，较为复杂[16, 17]。目前已被应用于结核分枝杆菌和沙眼衣原体[17]等病原检测。该技术的缺点主要是产物扩增后续检测复杂，且扩增产物不一[14, 15]。

......

第一部分 布鲁氏菌 RPA 检测方法的建立与应用

细菌是引起传染病最常见的病原微生物，如何快速检测这类病原，对控制疫情治疗患者十分重要。RPA 技术针对不同的检测靶标，具有不同的检测方法。这里我们以布鲁氏菌为细菌病原的代表，建立布鲁氏菌的 RPA 检测方法，探索 RPA用于细菌检测中的一些共性特征。
布鲁氏菌病是由布鲁氏杆菌引起的动物原性人畜共患病。布鲁氏菌可侵入人和多种动物引起变态反应性传染病, 染菌动物首先在同种动物间相互传播，造成带菌或发病，随后波及人类，危害人类健康，造成重大经济损失。布鲁氏菌病已被《中华人民共和国传染病防治法》列为乙类传染病[43,44]，被 WHO 喻为 21 世纪人类面临的最为严重的人畜共患病之一。传统上布鲁氏杆菌属可分为 6 个种（包括羊，牛，猪，绵羊附翠，沙林鼠，犬种）以及 19 个生物型[45]。不同种型其致病能力，感染人畜后症状、严重程度不同。羊种布鲁氏菌致病性最强，危害最为严重，常引起暴发流行。该病临床表现复杂多样，累及多个器官和系统，导致多种并发症[46]，常常难以诊断，加之缺乏有效地治疗方法，病人可能因发现较晚或未能确诊，使病情延误，继而转为慢性感染，复发率高、难以治愈。因此，准确快速的检测方法对布病患者的诊断和及时治疗意义重大。传统的布病实验室诊断主要包括分离培养和血清学检测，分离培养操作复杂、耗时久，并且检出率低，即使是阴性结果也不能下结论。血清学检测则由于抗原抗体出现的量和时间不一，各种血清学检测方法针对的抗体和适用对象也不同，常出现假阳性、假阴性结果。定量 PCR 等核酸扩增技术在对布鲁氏菌检测研究中表现出了良好的特异性和敏感性，但由于需要昂贵精密的 PCR 仪器，核酸扩增时间也较长，在临床应用中受到了限制[47-49]。

本研究以布鲁氏菌为细菌病原代表，基于 RPA 技术的原理，设计合成引物探针，通过筛选引物组合、优化体系、分析 mi 敏感性和特异性，建立布鲁氏菌的 RPA 检测方法，并应用于布鲁氏菌病患者实际样本检测，对方法进行评价，从而探讨 RPA 检测细菌病原中的共性问题。

......

1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 菌株与载体
羊种布鲁氏杆菌强毒株（B. melitensis, 16M）为军事医学科学院（中国人民解放军疾病预防控制中心）疾病预防控制所实验室保存。大肠杆菌 DH5α由康为世纪公司提供。其他菌种均由疾病预防控制所提供。PMD-18T 购自 TaKaRa公司。
1.1.2 主要试剂及配方
1.1.2.1 主要试剂
Taq MasterMix 康为世纪公司
Wizard SV Gel and PCR Clean-upSystemPromega 公司
Plasmid Mini Kit 康为世纪公司
Taq DNA 聚合酶，dNTP Takara 公司
PCR Clean-up systerm Promega 公司
T4 DNA 连接酶 NEB 公司
氨苄青霉素 HyClone 公司
胰蛋白胨大豆琼脂 (TSA) 培养基 生物梅里埃公司
胰蛋白胨大豆肉汤 (TSB) 培养基 生物梅里埃公司
TIANamp Bacteria DNAKit 天根生化科技（北京）
PCR 扩增所用引物 上海生工生物技术公司合成
SuperReal PreMix Plus (SYBR Green) 天根生化科技（北京）
RNasin Ribonuclease Inhibitor（RRI） Takara

TwistAmp exo kit TwistDx, Cambridge, UK

......

第三部分 埃博拉病毒 RPA 检测方法的建立与应用.......... 42
1 材料与方法........................................42
2 结果...............................................46
3 讨论..............................................52
4 小结.......................................53

参考文献........................................54

第二部分 腺病毒 RPA 检测方法的研究

病毒是传染病最为重要病原体，也是最容易引起新突发传染病的病原微生物种类。根据核酸检测靶标种类的不同，病毒分为 DNA 病毒和 RNA 病毒。DNA病毒和 RNA 病毒的检测方法是不同的，对于 DNA 病毒来说，其检测方法与细菌类似，不存在逆转录的步骤，相反 RNA 病毒则需要首先将其基因组 RNA 逆转录为 cDNA 才能进行扩增检测。腺病毒是引起感染的重要病原微生物，，属于DNA 病毒。由腺病毒感染引起的疫情，已经是严重威胁部队官兵健康的重要因素，建立该病原检测方法，对于部队腺病毒疫情的防控具有重要意义。

腺病毒是一种无囊膜的双链 DNA 病毒，在感染的细胞核内繁殖，分为 A-G7 个组 56 个血清型。常侵犯呼吸道、消化道黏膜和眼结膜等，导致呼吸道感染、胃肠炎、肺炎以及结膜炎等疾病，累及多个器官，小儿和免疫功能低下的人极易感染，且缺乏特效的治疗方法。作为一种人畜共患的急性传染病，在全球世界各地都曾暴发流行[51,52]。腺病毒主要的实验室检测方法包括病毒分离、免疫学检测和 PCR/Real-timePCR 等。病毒分离操作繁琐，耗时久，敏感性低又易污染。免疫学检测常出现假阳性和假阴性结果。PCR 需要精密笨重的仪器设备，反应时间也较长，不能满足疫情爆发时现场快速诊断的需要。对于腺病毒核酸检测来说，一个重要的特点不同型别的病毒的序列变异较大，因此，建立的方法应尽可能覆盖足够多的型别。本研究中，我们以腺病毒为研究对象，建立腺病毒的 RPA 检测方法，对方法的敏感性和特异性进行初步的评价。

......

第三部分 埃博拉病毒 RPA 检测方法的建立与应用

遗传物质为 RNA 的病毒属于 RNA 病毒。对于 RNA 病毒来说，在其复制过程中，需要转录出其互补的 DNA 或者 RNA。对于 RNA 病毒的检测，需要用逆转录酶将其RNA 逆转录为 cDNA，然后才能进行扩增，因此，RNA 病毒的检测与细菌和 DNA 病毒的检测不同，需要有逆转录的步骤。另外，很多 RNA 病毒的变异往往较 DNA病毒变异大。为了探讨 RNA 病毒的 RPA 检测方法，我们选择埃博拉病毒作为代表，建立该病毒的检测方法，并应用于实际样本的检测。
埃博拉病毒 EBOV 属丝状病毒科[53]，是单股负链 RNA 病毒[54]，常感染人和灵长类动物，引起埃博拉出血热病（EBOV Hemorrhagic Fever），该病感染率致死率极高。2014 年 3 月，几内亚首先出现埃博拉疫情，随后迅速蔓延至周边国家以及整个非洲，欧洲和美洲也被波及[55-57]。从爆发开始到 2015 年 4 月，已有28457 例患者感染，11297 例患者死亡，是迄今为止规模最大、疫情最严重的一次疫情，被 WHO 正式列为国际关注的公共卫生紧急事件。EBOV 实验室检测主要包括病毒分离，ELISA 以及 RT-PCR[58-61]。病毒分离操作复杂繁琐，周期长，需要在 BSL-4 实验室进行，因此不能作为常规检测方法。基于抗原抗体结合原理的ELISA 敏感性较低，常出现假阴性，对疾病的早期诊断不适用。RT-PCR 由于其高敏感性特异性等优点，成为此次 EBOV 疫情的主要诊断标准。然而 RT-PCR 这种实验室诊断方法需要精密的仪器设备，而且病毒核酸提取甚为复杂，很难应用于现场检测。因此，建立一种快速准确的 EBOV 检测方法对于治疗患者、控制疫情尤为重要。

本研究中，我们以 2014 年爆发流行的埃博拉毒株的基因组序列为靶标，针对病毒 N 蛋白基因序列，设计 RPA 引物探针，建立了检测方法，并对方法进行了应用评价。

......

参考文献（略）

本文编号：369964