不同品种灵芝营养物质及中药诱导多糖含量的研究
第一章 绪论
灵芝多糖主要是从野生灵芝或人工栽培灵芝的子实体、孢子粉和灵芝菌深层发酵培养产物菌丝体和发酵液中提取得到。多糖类物质是一类含有多羟基的化合物，主要包括糖脂、糖蛋白、蛋白聚等。多糖类物质提取原理是根据其易溶于水中、稀碱、稀酸中，而不易溶于乙醇乙醚等有机溶剂中的特性来进行提取分离。比较常用的方法是水提法、碱提法，提取的时间不能太长，以防止多糖水解。可以在提取多糖前使用乙醇、乙醚等有机溶剂浸泡灵芝子实体，这样可以去除样品中脂类的物质,并分解多糖的酶活性,以防止提取多糖过程中发生降解[8]。
提取多糖时还要除去样品中含有的蛋白质和其它的小分子物质。大部分的多糖不易在有机溶剂中溶解，可以使用乙醇进行多次的沉淀，最终可以提取出粗多糖。粗多糖中游离的蛋白质可用 Sevage 法去除[9]，将粗多糖溶于水中，以 4：1 三氯甲烷正丁醇混合，摇晃均匀。使用振荡器将三氯甲烷正丁醇混合液震荡至蛋白质变性，在乳化层中去除蛋白质，重复操作，直至有机层呈现澄清状态。在蛋白中的杂质清除之后，再用透析法除去小分子的杂质，最后使用乙醇沉淀多糖，既得到灵芝总多糖。罗立新等[10]采用冷热水、利用冷热碱液提取的方法，对灵芝子实体和菌丝体中的多糖进行提取，使多糖得到初步分级。根据料液比、提取温度、提取次数、提取时间等因素，对灵芝多糖提取各水平进行分析，最终选取最佳提取工艺，并对多糖进行了层析纯化，使多糖的纯度达到 96%以上。李坚等[11]使用紫外分光光度计以苯酚硫酸显色法在 490nm 处测定灵芝多糖的含量，得出试验结果，目前使用的苯酚硫酸法测定灵芝多糖含量数据比未改进前更为准确可靠。赵阳楠等[12]用苯酚硫酸法和间接碘量法，分别测定了同一供试品灵芝多糖的含量。得出结论，两种方法测定总糖含量基本一致。
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灵芝的化学成分较为复杂，从各灵芝属中分离出 150 余种化学成分。主要可分为：多糖类、呋喃类衍生物、核苷类、甾醇类化合物、氨基酸蛋白类、三萜类、生物碱类、油脂类、有机锗、无离子等[3]。灵芝在我国已有多年的历史。作为食药用真菌，在食用的过程中既有营养价值又有较高的药用价值。近些年来，灵芝的开发与利用越来越受到更多人的关注。灵芝的种类众多，随着科学技术的发展进步，人们不单方面只对灵芝进行研究，而是深入到灵芝的各个层面去研究，以求发现灵芝更多的用途。
灵芝三萜类化合物是一种具有较高脂溶性的化合物，其化学结构也较为复杂，高建莉等[13]对灵芝三萜类进行了研究，得出结论：灵芝中的三萜类化合物是灵芝的特殊有效成分，大多数具有苦味，依据分子中所含的碳原子数不同，可分为 C30，C27，C24 等三种。从不同的结构来看，灵芝三萜类化合物还可以分为灵芝酸，灵芝醇，灵芝酸甲酯，灵芝孢子酸，赤芝孢子内酯等多种类别。灵芝三萜类化合物的提取程序较为复杂，且有多种提取方法，其中超声波处理方法可以破坏灵芝的细密结构，提高三萜的提取率，并能够减少三萜类化合物提取时间。研究表明，灵芝三萜类化合物具有保肝作用，不仅对 CC14和 D-氨基半乳糖引起的肝损伤有保护作用，对免疫性肝损伤的治疗效果也极其显著，且 GT2的有效剂量明显要低于临床常见保肝药马洛替酯。同时灵芝三萜类化合物对免疫性肝损伤时升高的一氧化氮水平具有降低的表现[14-18]。
从现在医学研究中发现，灵芝在提高人体免疫力，减缓衰老的作用当中，效果显著。在调节人体的神经系统和减少人体的心脑血管疾病等方面有着重大的作用。从灵芝中提取出来的有效物质可以制成多种药剂，可以有效的抑制肿瘤、调节心脑血管、改善肝功能等。灵芝还可以和多种药物配合，来治疗神经衰弱夜不安、白细胞减少、糖尿病、冠心病、胃溃疡、肾炎、肝炎和三高等多种病症，灵芝所具有这些药理功效的根本是源于灵芝所含的营养物质和活性成分。本试验第一部分，通过对野生灵芝和人工栽培灵芝营养物质和活性成分比较，对比其之间的差异，为灵芝的食用、药用提供更有力的科学依据，发挥其潜在的更大功能，使不同灵芝得到更广泛的应用；第二部分，为不同灵芝发酵液筛选合适的中药来增加灵芝的活性成分，提高灵芝的品质，使其产生一定的经济效益，为灵芝的进一步开发提供指导作用。
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第二章 不同品种灵芝营养物质和活性成分含量分析
邢增涛[44]等人对不同品种灵芝中三萜类化合物比较研究表明不同品种的灵芝中三萜类化合物的种类和含量存在不同差异。郑林用[45]等人也对不同灵芝的多糖、三萜比较分析，表明不同灵芝的多糖和三萜类化合物是不相同的。周选伟[19]等人对灵芝蛋白类活性成分的研究进展，表明了蛋白质也是灵芝的重要营养成分。同时，还对灵芝所含的其它营养成分进行了研究，表明不同灵芝所含的营养成分是不同的。本章，通过对野生灵芝和人工栽培灵芝进行营养物质和活性成分比较分析，为灵芝的开发提供更有力的科学依据。
2.1.1 供试灵芝菌株
TU-1810 紫外可见分光光度计，北京普析通用仪器有限责任公司；电热恒温水浴锅，上海宜昌仪器纱筛厂；TGL-22 台式高速冷冻离心机，北京中科浩宇科技发展有限公司；AUX220 电子天平，日本岛津公司；DGG-9123A 型电热恒温鼓风干燥箱，上海森信实验仪器有限公司；中药粉碎机，江阴市富忠机械有限公司；红外石英消化炉 SKD-18S2，上海沛欧分析仪器有限公司；SX-5-12 马弗炉，南京晓晓仪器设备有限公司；等。
2.1.3 主要试剂
无水葡萄糖（分析纯）、苯酚(分析纯）、浓硫酸（分析纯）、香草醛、无水乙醇、乙醚、熊果酸、高氯酸、冰醋酸、硫酸铜、硫酸钾、氢氧化钠、甲基橙指示剂、硼酸、盐酸等。
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水浴锅 85℃预热，在样品中加入配置好的 85%无水乙醇 100mL，使用索氏提取器在水浴锅中回流提取 1h，过滤，弃滤液。再加入 85%无水乙醇，水浴锅中回流提取 1h。提取液过滤，弃滤液。然后再将醇沉后的样品滤渣中加入 100mL 蒸馏水，100℃沸水回流提取 2h，过滤，弃滤液。再重复加入 100mL 蒸馏水，100℃回流提取 2h，过滤，合并滤液。将样品溶液在 250mL 容量瓶中定容，摇匀。
精确吸取葡萄糖标准品溶液 0.3mL 0.6mL 0.9mL 1.2mL 1.5mL 1.8mL 置于具塞试管中，加蒸馏水至 2.0mL，摇匀。用蒸馏水 2.0mL 作为空白，然后冰浴中加入5%苯酚溶液1mL、浓硫酸 5mL 充分摇晃均匀，静置5min。再沸水浴中加热 15min后拿出，冷却至室温。按照紫外分光光度法，于 490nm 波长处测定其吸光度(Abs)。以葡萄糖浓度 mg·mL-1为横坐标，吸光度（Abs）为纵坐标，绘制标准曲线。
精确吸取熊果酸标准品溶液 0.2mL、0.4mL、0.6mL、0.8mL、1.0mL、1.2mL至具塞试管中，100℃水浴蒸干后加入 5%的香草醛-冰醋酸溶液 0.5mL，摇匀，再加入高氯酸溶液 0.8mL，置于 60℃水浴锅中 20min，取出后于冰浴中加入冰乙酸5mL，摇匀，室温下放置 15min。以无熊果酸对照品溶液的试管为空白，同法操作，于 548nm 条件下测定吸光度。以熊果酸（X）的质量为水平坐标，吸光度（Y）为垂直坐标绘制标准曲线。
在水蒸气发生瓶内装 2/3 的蒸馏水，同时加入甲基橙指示剂和硫酸，保持水为酸性，蒸馏装置装好后在电炉上加热。吸取硼酸试剂 20mL 置于三角瓶中，加入混合指示剂 2-3 滴。然后再吸取样品消化液 10mL 到反应管内，同时加入 10mLNaOH溶液，将玻璃塞塞好，并在入口处加水密封，防止漏气。加热煮沸水蒸气发生瓶内的水进行蒸馏，蒸馏 4min 降下锥形瓶，将冷凝管末端离开吸收液面，再蒸馏1min，用蒸馏水冲洗冷凝管末端，洗液均流入锥形瓶内，，然后停止蒸馏。重复三次，记录试验测定结果。
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3.1 试验材料与设备..................................................26
3.1.1 材料与仪器.................................................26
第四章 结论及展望.................................................31
4.1 主要研究结论.................................................31
4.1.1 不同品种灵芝之间营养物质与活性成分比较分析................31
4.1.2 提高灵芝活性成分途径初探...................................32
第三章 添加中药对不同品种灵芝菌丝体生物量和胞外多糖含量的影响
灵芝作为我国传统的珍贵医药，现代医学研究表明其药理作用功效显著[46-47]。食药用真菌的强大酶系可以分解利用蛋白质、脂类、纤维素、淀粉等物质，在培养基中添加一些中药成分可增强或抑制药用真菌的生长及代谢产物的产生。而食药用真菌中的酶系在液体发酵作用中可能会转化中药中的某些成分，包括对中药成分和灵芝活性成分的转化，以及它们之间相互作用下产生得到的新成分。筛选与食药用真菌无抑制作用的中药，以起到食药用真菌增加活性成分等作用[48]。本章通过在不同灵芝发酵液中添加垂盆草和板蓝根 2 种中药，测定对菌丝体生物量和胞外多糖含量的影响，为灵芝的进一步开发提供指导作用。
3.1.1 材料与仪器
3.1.1.1 灵芝品种
美芝、川芝 4 号、Gd1、Gd8、灵芝草、内蒙古野生灵芝均为本实验室保存的菌种，来源详见表 2-1。
3.1.1.2 中药
在灵芝液体发酵培养基中分别添加板蓝根、垂盆草 2 种中药。
3.1.1.3 主要仪器
JB-CJ-1500FX 净化工作台 苏州佳宝净化工程设备有限公司
LS-35HD 型立式压力蒸汽灭菌器 江阴滨江医疗设备有限公司
HZQ-F160 全温振荡培养箱 哈尔滨市东联电子技术开发有限公司
TGL-22 台式高速冷冻离心机 北京中科浩宇科技发展有限公司
3.1.2 培养基
3.1.2.1 斜面培养基
PDA 综合培养基配方：马铃薯 200g（去皮），葡萄糖 20g/L，磷酸二氢钾2g/L，硫酸镁 1g/L，VB12 片/L，琼脂 20g/L。
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第四章 结论及展望
4.1.1 不同品种灵芝之间营养物质与活性成分比较分析
1.通过对 15 种不同来源的野生灵芝和人工栽培灵芝的营养物质和活性成分测定分析比较得出：灵芝多糖的含量范围在 0.53%~3.05%之间，含量最高为易县野生白灵芝、易县野生云灵芝、泰山 3 号。总体来看，野生灵芝与人工栽培灵芝的多糖含量根据品种不同所测含量有所差异，并非野生灵芝的多糖含量全部高于人工栽培灵芝。由于灵芝多糖具有抗肿瘤、免疫调节等作用，建议在选择此方面保健或医药功能的灵芝时，可优先选择多糖含量较高的品种。
2.在灵芝三萜含量方面，野生灵芝和人工栽培灵芝的三萜类化合物含量范围在 0.47%~1.47%之间，野生灵芝与人工栽培灵芝三萜类化合物差异显著。野生灵芝三萜含量普遍高于人工栽培灵芝，这可能与野生灵芝在大自然中的生长环境有关。灵芝中的三萜类化合物是灵芝中一类特殊成分，对人体能起到有效的保肝护肝作用。因此对肝病患者而言，野生灵芝较人工灵芝具有更好的医疗保健作用。
3.在蛋白质方面，美芝粗蛋白含量达 32.05%，南韩 3 号与易县野生赤芝呈现极显著差异，易县野生赤芝粗蛋白含量仅为 7.52%。人工栽培的灵芝粗蛋白含量多数高于野生灵芝，说明人工栽培灵芝更有助于灵芝蛋白的合成。在实际生产中，如倾向于蛋白质含量高的灵芝药材，可优先选育美芝、南韩 3 号、Gd8。
4.从灵芝灰分含量来看，野生灵芝显著高于人工栽培灵芝。易县野生白灵芝灰分含量达 14.69%，而泰山 1 号灵芝灰分含量仅有 1.47%。灵芝灰分中含有大量的矿物质，具有调节机体生理功能，促进新陈代谢、清除体内毒素和废物的作用，在选择矿物质含量较高的灵芝时，可优先选择易县野生白灵芝、易县野生赤芝、易县野生云灵芝、美芝。
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参考文献（略）
本文编号：370064
本文链接：https://www.wllwen.com/wenshubaike/caipu/370064.html
