跑台运动对老龄大鼠腓肠肌线粒体 Sirt3 的影响

1 文献综述

1.1 骨骼肌增龄性萎缩
衰老是我们任何人都无法规避的自然规律，是一种复杂的具体表现为生物体结构与机能的退行性变化的现象。关于衰老的研究早已有之，衰老的自由基理论（Free Radical Theory OfAging）与衰老的程序性理论（Programmed Theory OfAging）是在众多衰老理论中最得到广泛认可的，而后又有学者在总结衰老的自由基理论上加以大量实验研究并提出了衰老线粒体理论（即衰老的自由基-线粒体理论），更加明确的指出了线粒体生成的 ROS 导致了细胞成分的增龄累积性的氧化损伤[4,5]。线粒体是细胞生成 ROS 的基础场所，也是 ROS 进行氧化攻击的主要目标。并且在人类细胞的复制性衰老过程中，伴随着 ROS 生成的增多，会导致线粒体数量上升，此结果又造成线粒体生成了更多的 ROS[6]，从而造成细胞氧化损伤程度的进一步加重。衰老线粒体理论指出人体内的 ROS 主要产生自线粒体，而线粒体内的 Mn-SOD 通过歧化反应抑制自由基的链式反应，进而维持体内的自由基平衡。但是，伴随着机体的衰老进程，这个平衡会被打破，导致细胞氧化应激水平的失衡，进而造成细胞损伤。而衰老细胞中的 ROS 又会不断的聚积，直接或间接的导致线粒体 ATP合成的减少、氧化磷酸化障碍以及呼吸链电子传递受阻甚至线粒体膜的通透性发生改变等线粒体的功能性障碍[7]。
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1.2 去乙酰化酶 3
Sirt3 是在线粒体中发现的具有脱乙酰化作用酶，属于沉默调节因子 2（silentinformation regulator 2，SIR2）家族（表 1），对维持与调节细胞线粒体正常生理功能及缓解细胞氧化应激作用具有重要意义。Sirt3 在肌肉、肾脏、褐色脂肪组织、心脏等代谢活跃组织中分布较多，而在睾丸、卵巢和肺等器官分布较少[23]。人体中的 Sirt3 是 NAD+依赖的脱乙酰基酶，与人类长寿相关。Sirt3 可以通过去乙酰化作用调节线粒体能量代谢相关酶的活性，进而维持机体 ATP 的稳态。在关于 Sirt3基因敲除的研究中，研究人员发现在肝脏、肾脏和心脏中，其安静状态下的 ATP 水平发生了明显的降低[24]。近来也有研究人员提出 Sirt3 可以通过控制线粒体中 ROS 的产生调节细胞的氧化还原平衡[25]（图 1）。Sirt3 基因敲除小鼠和 Sirt3 基因敲除的 C2C12 肌细胞的线粒体氧化作用比正常小鼠及细胞低下，ROS 生成量增加[26]。有研究提出线粒体 Sirt3 能够通过增强 Mn-SOD 的活性来提升机体的线粒体 ROS 的清除能力[27]。ROS 拥有需要获取电子以达到稳定的化学状态的特性，而此特性会对细胞组成成分造成伤害[28]。一些研究人员提出，转录因子（Fork head box O3, Foxo3a）经 Sirt3 去乙酰化作用后，进入细胞核，并提高了依赖于 Foxo3a 的抗氧化基因转录产物过氧化氢酶（catalase, CAT）及 Mn-SOD 的mRNA 的表达水平，并抑制了细胞内 ROS 的蓄积[29,30]。当前 Sirt3 对降低细胞内 ROS水平所起到的重要作用使之成为治疗 ROS 相关疾病（衰老、糖尿病、癌症以及神经退行性疾病等）中一个很重要的目标[3]。
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2 对象与方法

2.1 实验动物与分组
2.1.1 实验动物
20 只 12 月龄清洁级健康雄性 SD 大鼠（山东鲁抗医药公司），体重为 500±40g，许可证号：SCXK 鲁 20080002。

2.1.2 实验动物
饲养实验大鼠单笼饲养，不限制饮食，每天 12 小时自然光照，动物房内温度平均23℃-28℃，相对湿度为 50%±5%2.1.3 实验动物分组实验大鼠购买后，首先进行适应性饲养，为期一周。待大鼠状况稳定后随机将其分为运动组（exercise group，EG）和对照组（control group，CG），每组 10 只。
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2.2 动物实验
完成动物分组后，对照组大鼠不进行运动训练，自然生长，常规饮食，运动组大鼠开始进行适应性训练，为期一周。具体方法为逐渐加大跑台运动强度，每两天提速0.1km/h，时间为每天 0.5h，使其最终适应正式训练的运动强度。正式动物实验跑台训练计划如表 2 所示，共训练四周，每周递增训练时间 5min，每周训练 6 天，休息 1 天。训练时随时观察大鼠运动反应（精神状态、运动能力等），运动过程采用毛刷刺激大鼠尾部。大鼠出现卧位跑，反应迟钝等现象时，进行低于 5min 的休息后继续完成预定时间的运动。
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3 研究结果 ...... 13
3.1 大鼠体重变化情况 ....... 13
3.2 大鼠腓肠肌切片 ..... 13
3.3 大鼠腓肠肌细胞横截面积统计 ..... 14
3.4 腓肠肌细胞 Mn-SOD、MDA、8-OHdG 结果统计 ......... 14
3.5 Sirt3 与 PGC-1α 蛋白结果 ....... 14
4 讨论 ........ 17
4.1 运动对老年大鼠腓肠肌细胞形态学的影响 ......... 17
4.1.1 老年大鼠腓肠肌细胞形态学的变化 ......... 17
4.1.2 老年大鼠腓肠肌细胞横截面积的变化 ..... 17
4.2 运动对大鼠腓肠肌细胞 Sirt3 和 PGC-1α 蛋白含量的影响 ........ 18
4.3 运动对腓肠肌细胞氧化应激指标的影响 ....... 19
4.3.1 运动对腓肠肌细胞 Mn-SOD 活性的影响 ...... 19
4.3.2 运动对腓肠肌细胞 MDA 含量的影响 ...... 19
4.3.3 运动对腓肠肌细胞 8-OHdG 含量的影响 ....... 20

4 讨论

4.1 运动对老年大鼠腓肠肌细胞形态学的影响
组织病理学认为生物体的衰老源于细胞的衰老。骨骼肌是人体最大的运动器官，肌细胞又是人体中最大的细胞，因此针对骨骼肌生理与病理的研究多数要细化到细胞水平，而衰老也会导致骨骼肌细胞发生一系列形态上面的变化。骨骼肌细胞经 HE 染色后，肌纤维呈现粉红色，细胞核则呈现蓝紫色。正常骨骼肌纵切切片在显微镜下可观察到肌纤维排列紧密、横纹清晰、排列整齐且明暗相间，细胞核大小正常，位于肌纤维边缘（肌膜下）。而骨骼肌横切切片在显微镜视野中应观察到多角形的骨骼肌细胞，，肌核亦分布于细胞边缘，每个骨骼肌细胞应有 1-3 个细胞核，且大小正常。本次实验结果中，可由横切切片观察到对照组大鼠腓肠肌细胞呈现松散、不规则排列等特点，细胞核明显增多、变大且有内移趋势；而运动组大鼠腓肠肌细胞排列较为整齐、规则，细胞核皆位于细胞边缘，并能观察到骨骼肌细胞由多角形向圆形变化的趋势。经过以上骨骼肌细胞的衰老特征的比较，我们可以推测出运动对骨骼肌细胞的衰老有延缓作用，至少保证了其在形态功能上的完整性，进而有效的预防了骨骼肌增龄性萎缩。

结 论

跑台运动使大鼠腓肠肌Sirt3蛋白表达提高。跑台运动使大鼠腓肠肌Mn-SOD活性提高，降低了MDA和8-OHdG含量，说明运动干预降低了大鼠腓肠肌细胞的氧化损伤。跑台运动使大鼠腓肠肌PGC-1α蛋白表达提高。
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参考文献（略）