发育生物学 绪论(Introduction).ppt

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发育生物学西北师范大学生命科学学院DEVELOPMENTAL BIOLOGY 论 绪论 (Introduction)一、发育生物学的任务和研究对象1. 发育生物学 （developmental biology) 是应用现代生物学技术研究生物体发育的过程及其变化机制的科学研究生物体发育的过程及其变化机制的科学 。它是20 世纪50年代在年代在 胚胎学 （embryology) 的基础上，随着分子生物学、遗传学、细胞生物学和生物化学等分子生物学、遗传学、细胞生物学和生物化学等学科的发展以及它们与胚胎学的相互渗透而兴起的一门新的前缘学科。学科的发展以及它们与胚胎学的相互渗透而兴起的一门新的前缘学科。2. 发育生物学研究从生殖细胞发生、受精、胚胎发育、生长、成熟、衰老和死亡从生殖细胞发生、受精、胚胎发育、生长、成熟、衰老和死亡，即个体发育中生命现象发展的机制，以及，即个体发育中生命现象发展的机制，以及 异常发育如肿瘤、畸形 等。 3. 发育生物学研究的核心问题是 细胞分化 (cell differentiation). 细胞分化是指由一种类型的细胞产生的细胞类型的多样性。4. 发育生物学研究有机体细胞的每一个分子、每一个细胞、每一种组织、每一个器官和每一种有机体，因为它们的起源和形成都离不开发育。珠蛋白基因的转录和青蛙鳃的形成对发育生物学家来说是同样正当的问题。发育生物学的研究并不局限于有机体的任一系统、组织或器官。这意味着发育生物学可能是生物学科的最广泛的概括。发育的研究把所有的生物学领域连接在一起。发育生物学研究有机体细胞的每一个分子、每一个细胞、每一种组织、每一个器官和每一种有机体，因为它们的起源和形成都离不开发育。珠蛋白基因的转录和青蛙鳃的形成对发育生物学家来说是同样正当的问题。发育生物学的研究并不局限于有机体的任一系统、组织或器官。这意味着发育生物学可能是生物学科的最广泛的概括。发育的研究把所有的生物学领域连接在一起。 二、发育的基本模式（一） 发育的基本特点:多细胞有机体的产生是一个相对缓慢和渐进的变化过程，我们将其称为多细胞有机体的产生是一个相对缓慢和渐进的变化过程，我们将其称为 发育 （development) 。 其特征是具有严格的时间和空间的次序性，这种次序性是由发育的遗传程序控制，发育是有机体的各种细胞协同作用的结果其特征是具有严格的时间和空间的次序性，这种次序性是由发育的遗传程序控制，发育是有机体的各种细胞协同作用的结果, 也是一系列基因网络性调控的结果.发育完成两大功能：1. 产生细胞的多样性和在每一代中的条理性。从单个的受精卵产生不同类型的细胞，如肌肉细胞、皮肤细胞、神经元、淋巴细胞、血细胞和所有其它类型的细胞。我们把细胞多样性的产生称为。从单个的受精卵产生不同类型的细胞，如肌肉细胞、皮肤细胞、神经元、淋巴细胞、血细胞和所有其它类型的细胞。我们把细胞多样性的产生称为 分化 （differentiation) ， 是一个质变的过程。由已分化的细胞形成组织和器官的过程称为是一个质变的过程。由已分化的细胞形成组织和器官的过程称为 形态发生 （morphogenesis) 。 发育的过程还包括发育的过程还包括 生长 （growth) ， 这是一个量变的过程。2. 确保从一代到下一代生命的连续性, 即 增殖 （reproduction). 以保证该物种新个体的持续产生。以保证该物种新个体的持续产生。 （二）发育的基本过程：1. 配子发生 (gametogenesis) ： 产生成熟的精子 （sperm) 和卵子 (ovum)的过程。2. 受精 (fertilization) ： 为精子和卵子相遇并结合的过程。3. 卵裂 (cleavage) 和 囊胚 (blastula) ： 受精卵连续分裂，产生的细胞称为卵裂球 （blastomeres) ， 然后由它们形成多细胞的囊胚。4. 原肠形成 (gastrulation): 囊胚的细胞经过多种多样的形态发生运动（ （morphogenetic movement ） 产生由外胚层 (ectoderm) 、中胚层(mesoderm) 和内胚层 (endoderm) 组成的原肠胚 （gastrula ） 。5. 器官发生 （organgenesis ）： 三胚层的细胞相互作用分化形成各种不同器官的原基。6. 变态 (metamorphosis) ： 有些动物，如两栖类和昆虫，在发育过程中经历一个幼虫 （larva ） 阶段，然后经过“脱胎换骨”的变化发育为成体的过程。 三、发育生物学的发展简史发育生物学是由于细胞生物学、遗传学、生物化学及分子生物学等其他生命学科的发展和与胚胎学的相互渗透，在胚胎学的基础上发展和形成的一门新兴的生命科学。发育生物学是由于细胞生物学、遗传学、生物化学及分子生物学等其他生命学科的发展和与胚胎学的相互渗透，在胚胎学的基础上发展和形成的一门新兴的生命科学。（一） 先成论 (preformation) 和后成论 (epigenesis)早在公元前, Aristotle (384 一322) 认为动物胚胎和成体动物各种结构形成的原因只有两种可能：认为动物胚胎和成体动物各种结构形成的原因只有两种可能：一是卵子或精子中本来具有微小的结构一是卵子或精子中本来具有微小的结构 ，在发育过程中逐渐长大形成胚胎和成体的结构；二是卵子或精子中本来并不具有这些结构，而是在发育过程中逐渐形成的二是卵子或精子中本来并不具有这些结构，而是在发育过程中逐渐形成的.在观察鸡和一些无脊椎动物胚胎发育的基础上，他首先提出了胚胎是在观察鸡和一些无脊椎动物胚胎发育的基础上，他首先提出了胚胎是 由简单到复杂 逐渐发育 形成的（ 后成论）。但到了公元）。但到了公元17 世纪后期和18 世纪，以 精源学说 和 卵源学说为代表的为代表的 先成论占统治地位。 精源学说认为胚胎预先存在于精子中，卵源学说则认为卵子中本来就存在微小的胚胎雏形。其共同点都占统治地位。 精源学说认为胚胎预先存在于精子中，卵源学说则认为卵子中本来就存在微小的胚胎雏形。其共同点都 认为胚胎是成体的雏形 ，是配子中本来固有的结构,胚胎发育仅仅是原有结构的增大。胚胎发育仅仅是原有结构的增大。1759 年德国Wollf (Theoria Generationis 和Formatione Intestinorum) 再次提出了再次提出了 后成论 观点。Wollf根椐对鸡胚发育的观察，认为卵子中本来并不存在胚胎结构，胚胎与成体也并不相同，胚胎发育是逐渐变化的过程。根椐对鸡胚发育的观察，认为卵子中本来并不存在胚胎结构，胚胎与成体也并不相同，胚胎发育是逐渐变化的过程。 后成论直到19 世纪才为人们所接受 。 （二）胚胎学 (embryology)1. 描述胚胎学 (descriptive embryology)2. 比 较胚胎学 (comparative embryology): 重演学说 (recapitulationtheory) 或 生物发生律 (biogenetic law) 和 进化论 (evolution theory) 。3. 实 验 胚 胎 学 (experimental embryology): 镶 嵌 型 发 育 (mosaicdevelopment; Weismann, determinant; Roux) 和 调整型发育 (regulativedevelopment; Driesch)胚胎是由一个单细胞的合子经过一系列的分裂和分化产生的。19 世纪80 年代,Weismann就提出了关于细胞、染色体和基因与胚胎发育关系的理论。他就提出了关于细胞、染色体和基因与胚胎发育关系的理论。他 认为合子的细胞核含有大量特殊的信息物质——决定子 (determinants), 在卵裂的过程中被平均分配到子细胞中去控制子细胞的发育命运。细胞的命运实际上是由卵裂时所获得的合子核信息早已预定的。这一类型发育称为在卵裂的过程中被平均分配到子细胞中去控制子细胞的发育命运。细胞的命运实际上是由卵裂时所获得的合子核信息早已预定的。这一类型发育称为 嵌合型发育 。 Weismann 理论的核心 强调早期卵裂必须是不对称分裂。由于合子成分的不均匀分布，其卵裂的结果产生的子细胞彼此之间是完全不同的。胚胎学家。由于合子成分的不均匀分布，其卵裂的结果产生的子细胞彼此之间是完全不同的。胚胎学家 Roux (1887) 用烧热的针破坏两细胞期蛙胚的一个分裂球，结果存活的另一个分裂球只发育为半个胚胎。由此他用烧热的针破坏两细胞期蛙胚的一个分裂球，结果存活的另一个分裂球只发育为半个胚胎。由此他认为蛙的认为蛙的 胚胎发育存在嵌合型发育机制 ，细胞的特征和命运是在卵裂的过程中决定的细胞的特征和命运是在卵裂的过程中决定的。但是。但是 Driesch (1891) 用海胆为实验材料重复Roux的实验却得到了完全不同的结果。他在海胆两细胞时期将两个分裂球分开的实验却得到了完全不同的结果。他在海胆两细胞时期将两个分裂球分开,得到了两个发育正常的、个体较小的 海胆幼体。得到了两个发育正常的、个体较小的 海胆幼体。Driesch的实验结果第一次证明发育过程中存在的实验结果第一次证明发育过程中存在 调整型发育 机制。 4. 胚胎诱导 作用(embryonic induction) 和 组织者(organizer;Spemann 和Mangold, 1924)Driesch(1876-1941)提出的调整型发育机制已经涉及细胞之间的相互作用，但是一直到诱导现象发现之后，人们才真正认识到，提出的调整型发育机制已经涉及细胞之间的相互作用，但是一直到诱导现象发现之后，人们才真正认识到，细胞之间的相互作用是胚胎发育最重要的核心 问题.诱导是指一类组织与另一类组织的相互作用 ，前者称为 诱导者(inductor) , 后者称 反应组织 ，诱导者可指令邻近反应组织的发育.1924 年Spemann 进行了 著名的胚孔背唇移植实验。将蝾螈原肠胚早期的胚孔背唇组织移植到另一同期受体胚胎的胚孔侧唇表面，随着受体胚胎发育的进程，大部分移植组织也内陷进入胚胎内，发现到原肠胚后期诱导产生了另一个次生胚。由于胚孔背唇组织。将蝾螈原肠胚早期的胚孔背唇组织移植到另一同期受体胚胎的胚孔侧唇表面，随着受体胚胎发育的进程，大部分移植组织也内陷进入胚胎内，发现到原肠胚后期诱导产生了另一个次生胚。由于胚孔背唇组织具有调控和组织一个几乎完整的胚胎产生的特殊能力具有调控和组织一个几乎完整的胚胎产生的特殊能力, 故称 组织者 。 发育中的诱导和细胞之间相互作用的重要性才因此得到充分的重视。由此重大发现发育中的诱导和细胞之间相互作用的重要性才因此得到充分的重视。由此重大发现, Spemann 在1935 年获得 诺贝尔医学奖. （三） 细胞学理论和胚胎学1839 年德国植物学家Schleiden 和生理学家Schwann 指出，所有生物有机体都由细胞构成所有生物有机体都由细胞构成，细胞是生命的基本单位；通过细胞的有丝分裂产生其他细胞。因此，细胞是生命的基本单位；通过细胞的有丝分裂产生其他细胞。因此发育也必然是逐渐变化的过程发育也必然是逐渐变化的过程. 在胚胎发育中, 通过受精卵的分裂产生许多新细胞和新的细胞类型产生许多新细胞和新的细胞类型.到19 世纪40年代，对卵子的特性开始有所认识，认识到卵子也是一个细胞（年代，对卵子的特性开始有所认识，认识到卵子也是一个细胞（ 一个特殊细胞 ）。Weismann 进一步提出后代所具有的双亲遗传特性来自于生殖细胞后代所具有的双亲遗传特性来自于生殖细胞，来自于两性配子所携带的遗传特性。之后，来自于两性配子所携带的遗传特性。之后 对海胆等的研究进一步显示，在受精初期的研究进一步显示，在受精初期 受精卵中包含两个细胞核，其中一个来源于卵子，另一个来源于精子，在受精过程中两个细胞核融合。到，其中一个来源于卵子，另一个来源于精子，在受精过程中两个细胞核融合。到19 世纪后期，人们通过一系列研究 认识到，合子细胞核的染色体中各有一半分别来源于两个亲代合子细胞核的染色体中各有一半分别来源于两个亲代 ，而合子的遗传信息在卵裂过程中平均分配到子细胞中去合子的遗传信息在卵裂过程中平均分配到子细胞中去，这就为遗传特性的传递提供了物质基础。，这就为遗传特性的传递提供了物质基础。 （四）胚胎学和遗传学的结合Boveri (1902) 对海胆的研究发现，正常的胚胎发育决定于正常的染色体组型正常的胚胎发育决定于正常的染色体组型. 之后的研究进一步提出 基因型 (genotype) 与表型 (phenotype)的概念。 基因型是有机体从双亲获得的遗传信息所赋有的特性.有机体在不同发育时期表现出来的形态、结构、生化等特征称为表型在不同发育时期表现出来的形态、结构、生化等特征称为表型 。由基因型控制发育，同时有机体的表型又受到环境因子与基因型的共同影响由基因型控制发育，同时有机体的表型又受到环境因子与基因型的共同影响 。如孪生兄弟。所以发育实际上看作是基因型与表型的结合发育实际上看作是基因型与表型的结合.发育受遗传信息的控制，在发育过程中合子从双亲获得的遗传信息是如何表达的，一个单细胞的合子又是如何发育成为具有功能的有机体的，要回答这些难题，需要将发育受遗传信息的控制，在发育过程中合子从双亲获得的遗传信息是如何表达的，一个单细胞的合子又是如何发育成为具有功能的有机体的，要回答这些难题，需要将遗传学和胚胎学的研究结合遗传学和胚胎学的研究结合 起来。 随着基因编码蛋白质的发现 ，不少问题迎刃而解.细胞的性质是由细胞中所包含的蛋白质决定的，而这些蛋白质由基因编码，而这些蛋白质由基因编码 。 基因通过其编码产物—蛋白质的变化控制发育分化中细胞的性质和习性蛋白质的变化控制发育分化中细胞的性质和习性. 遗传和发育是个体发生过程的两个方面 。对于发育性状的研究，既可以从遗传现象出现的角度进行研究，又可以从发育过程进行研究。对于发育性状的研究，既可以从遗传现象出现的角度进行研究，又可以从发育过程进行研究。 发育受遗传程序的控制，遗传特性通过发育展现出来发育受遗传程序的控制，遗传特性通过发育展现出来. （五）分子生物学和发育生物学发育生物学是个新兴学科。 自从Watson 和Crick (1953) 根据X衍射和化学分析提出衍射和化学分析提出DNA 分子的双螺旋模型 以后，特别是60 年代Nirenberg 对DNA 遗传密码 的破译，Jacob 和Monocl (1960) 提出并证明蛋白质合成调控机制的提出并证明蛋白质合成调控机制的 操纵子学说 等 研究成果，使分子生物学迅速发展研究成果，使分子生物学迅速发展.分子生物学与遗传学的结合，人们逐渐认识到遗传信息主要是编码在细胞核内基因组遗传信息主要是编码在细胞核内基因组DNA 的一级序列，发育受遗传的控制。为回，发育受遗传的控制。为回组 答发育的遗传程序是以何种方式编码在基因组 DNA上，编码在上，编码在DNA 上的遗传信息又如何控制生物体的发育等 问题，人们开始采用分子生物学方法和各种新兴的生物学技术，进行发育机制的研究开始采用分子生物学方法和各种新兴的生物学技术，进行发育机制的研究.目前对于 果蝇和线虫发育的分子控制机制已基本阐明。在此基础上，。在此基础上，利用发育调控基因在进化上的保守性，开展了对脊椎动物发育分子机制的深入研究利用发育调控基因在进化上的保守性，开展了对脊椎动物发育分子机制的深入研究，对于斑马鱼、非洲爪瞻、小鼠、鸡和文昌鱼等模式动物的研究已取得一系列重大的突破，对于斑马鱼、非洲爪瞻、小鼠、鸡和文昌鱼等模式动物的研究已取得一系列重大的突破.由于发育生物学的迅速发展，由于发育生物学的迅速发展，发育生物学已成为当代生命科学研究的前沿和热点领域之一发育生物学已成为当代生命科学研究的前沿和热点领域之一. 四、发育生物学模式生物现代发育生物学研究主要集中于几种模式生物，包括果蝇、线虫、非洲瓜瞻、斑马鱼、鸡和小鼠果蝇、线虫、非洲瓜瞻、斑马鱼、鸡和小鼠等。对于发育分子机制的认识也主要来源于对这些模式生物的研究。模式动物各有优缺点,但都具备一些共同特征：等。对于发育分子机制的认识也主要来源于对这些模式生物的研究。模式动物各有优缺点,但都具备一些共同特征：①取材方便。在实验室条件下，这些动物常年可产卵，随时可获得胚胎材料，。在实验室条件下，这些动物常年可产卵，随时可获得胚胎材料， 饲养管理简单，维持费用低 。②胚胎具有较强的可操作性。胚胎一般较大，相关实验技术如显微注射等比较完善。。胚胎一般较大，相关实验技术如显微注射等比较完善。③可进行遗传学研究。上述物种中果蝇、线虫和斑马鱼均可用于大规模遗传突变研究，小鼠的基因敲除技术已相当完善，非洲爪瞻的转基因技术较有优势。。上述物种中果蝇、线虫和斑马鱼均可用于大规模遗传突变研究，小鼠的基因敲除技术已相当完善，非洲爪瞻的转基因技术较有优势。此外,棘皮动物 海胆 和尾索动物 海鞘 也都是较为常用的 模式动物, 文昌鱼是研究动物进化的模式生物, 水螅涡虫 常被用予 再生机制的研究 （一）脊椎动物模式生物1. 两栖类：非洲爪蟾 (Xenopus laevis)两栖类动物是早期胚胎学研究的经典动物模型。在20世纪早期，常用的动物是世纪早期，常用的动物是 蝾螈和蜥蜴 ，50年代以后，非洲爪瞻逐渐成为主要两栖类动物模型。非洲爪瞻的优势是年代以后，非洲爪瞻逐渐成为主要两栖类动物模型。非洲爪瞻的优势是:取卵方便.在实验室条件下，非洲爪蟾可常年产卵，不受季节限制。只需要注射激素，雌体第在实验室条件下，非洲爪蟾可常年产卵，不受季节限制。只需要注射激素，雌体第2 天 就可产卵产卵量大, 卵可通过人工授精获得受精卵 。卵子和胚胎个体较大, 直径可达1. 4mm,很方便进行实验胚胎学研究，如显微注射、胚胎切割和移植等。很方便进行实验胚胎学研究，如显微注射、胚胎切割和移植等。早期胚胎发育很快 ，，在24 o C 下 受精后 2 天左右就可以孵化为可自由游动的幼虫左右就可以孵化为可自由游动的幼虫.非洲瓜蟾的研究为我们认识脊椎动物的发育机制做出了重要贡献。非洲瓜蟾的研究为我们认识脊椎动物的发育机制做出了重要贡献。 非洲爪蟾的生命周期如 图绪. 1 。非洲爪瞻的 成熟卵子具有明确的动物极和植物极之分。动物极含有大量色素颗粒而卵黄较少，植物极则含有丰富的卵黄而色素颗粒较少。受精时精子于动物半球的任意位点人卵。之分。动物极含有大量色素颗粒而卵黄较少，植物极则含有丰富的卵黄而色素颗粒较少。受精时精子于动物半球的任意位点人卵。受精作用引起受精作用引起 皮质运动 (cortical rotation) ， 质膜下的皮质胞质相对于内部的胞质部分旋转约质膜下的皮质胞质相对于内部的胞质部分旋转约30 o 。在这一过程中原来位于植物半球的背部决定因子被转运至精子人卵处的对侧。在这一过程中原来位于植物半球的背部决定因子被转运至精子人卵处的对侧 ，即未来胚胎的背侧爪蟾 胚胎经过卵裂、囊胚（3.5 h ）、原肠胚(11 h) 、神经胚(18 h)及尾芽期(25 h) 等阶段孵化成为幼虫(66 h) 。蝌蚪在5 天左右后肢开始发育并逐渐进入变态期左右后肢开始发育并逐渐进入变态期 ，到2 个月时完成变态。幼体要生长月时完成变态。幼体要生长1 -2 年才能达到性成熟。 虽然X. laevis作为动物模型有许多优点，但也存在着重要缺陷，即作为动物模型有许多优点，但也存在着重要缺陷，即 很难进行遗传学研究 。主要是由于其 生命周期过长 ，同时，X. laevis 是异源四倍体 ，多数基因都存在4个拷贝，很难进行遗传突变实验。近年来，另一个个拷贝，很难进行遗传突变实验。近年来，另一个X. laevis 的近缘品种一X.tropicalis开始进入人们的视野。与开始进入人们的视野。与X. laevis 相比，X. tropicalis个体较小，世代周期短个体较小，世代周期短( 约4 个月) ， 是二倍体品种，因而比较适于进行遗传学实验。它同时，因而比较适于进行遗传学实验。它同时 也具备X. laevis 所具有的实验胚胎学研究优势，如激素诱导产卵，产卵量大等。，如激素诱导产卵，产卵量大等。X. tropicalis 的卵直径0.6 -0.7 mm，足以进行显微操作实验。在，足以进行显微操作实验。在X. laevis中建立的实验方法均可直接应用于中建立的实验方法均可直接应用于X. tropicalis 中。目前X. tropicalis的基因组测序已接近完成的基因组测序已接近完成 。X. tropicalis 有望成为重要的发育遗传学研究模型。 2. 鱼类：斑马鱼 (Danio rerio)20 世纪60 年代，美国Oregon 大学Streisinger G就开始了对斑马鱼的研究。就开始了对斑马鱼的研究。90 年代，由Nilsslein Volhard C 和Driever W分别领导的实验室开展了斑马鱼的大规模突变筛选，得到了大约分别领导的实验室开展了斑马鱼的大规模突变筛选，得到了大约4000个突变品系。此次筛选成为斑马鱼研究领域的里程碑。此后斑马鱼的研究得到了迅速发展。斑马鱼作为发育生物学模式生物有两个明显的优势：。此次筛选成为斑马鱼研究领域的里程碑。此后斑马鱼的研究得到了迅速发展。斑马鱼作为发育生物学模式生物有两个明显的优势：一是世代周期短一是世代周期短 ( 约3 个月) ， 二是胚胎透明 ，易于观察，同时饲养管理较为简单，容易进行杂交实验饲养管理较为简单，容易进行杂交实验 。斑马鱼是目前唯一可以进行大规模遗传突变筛选的脊椎动物斑马鱼是目前唯一可以进行大规模遗传突变筛选的脊椎动物.斑马鱼的 基因组测序已接近完成，相关的遗传学和形态学研究技术也比较完善，斑马鱼已成为，相关的遗传学和形态学研究技术也比较完善，斑马鱼已成为最好的脊椎动物发育遗传学研究体系最好的脊椎动物发育遗传学研究体系 之一. 斑马鱼的卵属于 端黄卵，胚盘位于卵黄之上。早期的卵裂为，胚盘位于卵黄之上。早期的卵裂为盘状不完全卵裂盘状不完全卵裂，囊胚期胚胎形成一个细胞球位于卵黄上，而囊胚腔并不明显。，囊胚期胚胎形成一个细胞球位于卵黄上，而囊胚腔并不明显。位于囊胚边缘的细胞与卵黄并不完全分隔位于囊胚边缘的细胞与卵黄并不完全分隔。到囊胚期，这些细胞与卵黄细胞融合，形成一个合胞体层，称为。到囊胚期，这些细胞与卵黄细胞融合，形成一个合胞体层，称为卵黄合胞体层卵黄合胞体层 (yolkl syncytial layer ，YSL) 。到囊胚晚期，卵黄合胞体层与胚盘开始向下包被卵黄合胞体层与胚盘开始向下包被。到原肠作用结束时。到原肠作用结束时,卵黄细胞被完全包被在胚胎内部。原肠作用后，体节、神经管和其他器官原基开始出现。斑马鱼胚胎在受精后卵黄细胞被完全包被在胚胎内部。原肠作用后，体节、神经管和其他器官原基开始出现。斑马鱼胚胎在受精后48 h左右开始孵化为自由游动的幼体。左右开始孵化为自由游动的幼体。 3. 鸟类：鸡鸡的胚胎发育过程与哺乳动物更为接近. 由于鸡胚 在体外发育，相对于哺乳动物更容易进行实验研究，相对于哺乳动物更容易进行实验研究 ，相应的研究手段已比较成熟研究手段已比较成熟 。鸡胚是 研究附肢、体节等器官发育机制的重要模型 。鸡的基因组测序也已完成 。鸡卵在输卵管内完成受精，在排卵过程中逐渐包被上卵清、壳膜和蛋壳。 卵细胞质和核位于卵黄上方卵细胞质和核位于卵黄上方2-3mm的狭小区域。受精卵经卵裂形成的狭小区域。受精卵经卵裂形成 胚盘 ，胚盘中央逐渐与卵黄分离，形成 胚下腔。随后一部分细胞迁移至胚下腔内卵黄上方，形成。随后一部分细胞迁移至胚下腔内卵黄上方，形成 下胚层，位于表面的胚层为，位于表面的胚层为 上胚层 ，两者之间为 囊胚腔。上胚层后部细胞向中间迁移，使中央部分加厚形成。上胚层后部细胞向中间迁移，使中央部分加厚形成 原条，原条逐渐向前延伸，其最前端细胞变得更密集，称为，原条逐渐向前延伸，其最前端细胞变得更密集，称为 亨氏结 (Hensen‘snode) 。 预定中胚层和内胚层细胞通过原条中央的 原沟迁入囊胚腔内部迁入囊胚腔内部-- 即原肠作用。随后原条开始逐渐回缩，胚胎开始出现脊索、体节、神经板等结构。伴随其发育，胚胎还形成复杂的胚外膜系统，包括卵黄囊、尿囊。随后原条开始逐渐回缩，胚胎开始出现脊索、体节、神经板等结构。伴随其发育，胚胎还形成复杂的胚外膜系统，包括卵黄囊、尿囊 等。卵黄囊为胚胎的发育提供营养，而尿囊是胚胎的呼吸器官并贮存代谢废物。等。卵黄囊为胚胎的发育提供营养，而尿囊是胚胎的呼吸器官并贮存代谢废物。 鸡胚在孵育21天后孵化成为小鸡天后孵化成为小鸡 4. 哺乳动物：小鼠胚胎发育过程与人类比较接近，作为很多人类疾病的动物模型小鼠的，作为很多人类疾病的动物模型小鼠的 世代周期约 2 个月 ，这在哺乳动物中是相当短的。其基因组测序已经完成基因组测序已经完成 ，遗传学背景较为清楚，相应的遗传学实验手段如转基因、基因敲除等也比较完善相应的遗传学实验手段如转基因、基因敲除等也比较完善 。小鼠是目前唯一可以进行基因敲除实验的脊椎动物是目前唯一可以进行基因敲除实验的脊椎动物。最大。最大 缺点是其胚胎在母体内发育，胚胎个体很小，很难实验操作.小鼠成熟卵外包被 透明带 (zona pellucida ) ， 受精和卵裂均在输卵管内进行受精和卵裂均在输卵管内进行. 在8 细胞时 胚胎发生紧密化 (compaction) 形成实心球体，至形成实心球体，至32 细胞时称 桑椹胚 (morula). 此后出现 囊胚腔. 胚胎分化为滋养外胚层滋养外胚层 (trophectoderm ) 和 内细胞团 (inner cell lPass) — 胚泡 (blastocyst) 。内细胞团将发育成为胚胎本身，而滋养外胚层发育为胚外组织。E4.5 天 时胚泡到达子宫从透明带中孵出并植入子宫壁。此后小鼠胚胎的发育过程与鸡胚类似此后小鼠胚胎的发育过程与鸡胚类似. 内细胞团逐渐发育为一个中空的柱状结构，称为内细胞团逐渐发育为一个中空的柱状结构，称为 卵柱 (egg cylinder) .卵柱中 位于囊胚腔表面的细胞分化为脏壁内胚层位于囊胚腔表面的细胞分化为脏壁内胚层 (visceral endoderm) ,与鸡胚的下胚层相当，将来分化为胚外组织与鸡胚的下胚层相当，将来分化为胚外组织; 而位于内部的内胚团细胞与鸡胚的上胚层相当内部的内胚团细胞与鸡胚的上胚层相当.卵柱中央的腔将来成为羊膜腔.在E6.5 天 时，在 上胚层 一侧出现原条原条, 原条向前延伸，其前端出现原节 (node.) 。 胚胎的预定中胚层和内胚层细胞通过原条迁入胚胎内部胚胎的预定中胚层和内胚层细胞通过原条迁入胚胎内部 。随后原条回缩,胚胎开始出现神经板、脊索、体节等。到胚胎开始出现神经板、脊索、体节等。到E8. 5 天 ，胚胎的头褶 (head fold) 已相当清楚已相当清楚.胚胎开始沿它的长轴扭转胚胎开始沿它的长轴扭转 ， 经扭转过程，胚胎被羊膜和羊膜液完全包围经扭转过程，胚胎被羊膜和羊膜液完全包围.小鼠幼仔在受孕后小鼠幼仔在受孕后19 - 20 天出生 (二)无脊椎动物模式生物1. 果蝇 (Drosophila melanogaster)果蝇是遗传学的经典模式生物，已有100多年的研究历史。但作为发育生物学研究模型，在早期并未受到重视。多年的研究历史。但作为发育生物学研究模型，在早期并未受到重视。1980 年初，德国科学家Nesslein-Volhard C 和美国学者Weichaus E以果蝇作为材料，以果蝇作为材料， 研究发育调控的遗传基础，他们和另一位美国遗传学家，他们和另一位美国遗传学家Lewis E B 分享 了1995年诺贝尔生理学或医学奖。果蝇为双翅目昆虫，年诺贝尔生理学或医学奖。果蝇为双翅目昆虫，个体小，生命周期短，繁殖容易，操作简便，成本低廉，个体小，生命周期短，繁殖容易，操作简便，成本低廉， 其 胚胎和成体都具有丰富的表型特征。果蝇。果蝇 是目前遗传学背景最清楚的物种 ，其基因组序列测序已全部完成基因组序列测序已全部完成( 约包含13 600 个基因)，相关遗传学研究手段非常完备，在长期的遗传学研究过程中积累了大量遗传突变品系，为果蝇的发育遗传学研究提供了有利条件。，相关遗传学研究手段非常完备，在长期的遗传学研究过程中积累了大量遗传突变品系，为果蝇的发育遗传学研究提供了有利条件。 果蝇在250 C 下 由卵至成虫约需11 天 ，经过卵、幼虫、蛹和成虫4个阶段。 果蝇卵呈长椭圆形，精子通过卵壳前部的卵孔入卵. 其胚胎发育很快胚胎发育很快 ， 受精卵在24h 内就可以孵化为幼虫.卵裂为 表面卵裂。在早期阶段，合子核进行一系列快速分裂，而胞质不分裂，形成。在早期阶段，合子核进行一系列快速分裂，而胞质不分裂，形成 合胞体 (syncytium). 核第8 次分裂 后,在胚胎最后部的核最先被细胞膜分隔形成在胚胎最后部的核最先被细胞膜分隔形成 极细胞 ， 将形成生殖细胞 。核第核第9 次分裂 后，大部分核开始迁移到卵的边缘，称为合胞体胚盘合胞体胚盘 (syncytial blastoderm). 受精约3 个小时后，卵周边的核被新形成的胞膜包围，形成，卵周边的核被新形成的胞膜包围，形成 细胞化胚盘 (celluar blastoderm).原肠作用过程 ( 图绪.8) 中，先是胚胎腹侧的预定中胚层细胞沿腹中线内陷胚胎腹侧的预定中胚层细胞沿腹中线内陷 ，形成 腹沟 (ventral furrow) 。 随后这部分细胞与表层组织分离，形成随后这部分细胞与表层组织分离，形成 中胚层管。这些细胞将迁移至外胚层下，发育成为肌肉和其他结缔组织。。这些细胞将迁移至外胚层下，发育成为肌肉和其他结缔组织。随着中胚层组织的内陷，原来位于胚胎背侧的细胞也逐渐向腹侧迁移集中随着中胚层组织的内陷，原来位于胚胎背侧的细胞也逐渐向腹侧迁移集中。仍停留在背侧的少量细胞不再继续分裂，也不参与胚胎本身的构成，而是形成胚外组织，称为。仍停留在背侧的少量细胞不再继续分裂，也不参与胚胎本身的构成，而是形成胚外组织，称为 羊浆膜 (amnioserosa) 。 而 集中于胚胎腹侧的细胞带 称为 胚带(germ band) 。 胚带 包含了外胚层和位于其下方的中胚层组织 ，将来形成胚胎的主体结构形成胚胎的主体结构 ， 也是将要分节的部分 。位于 外胚层最腹侧的预定神经母细胞逐渐陷入胚胎内部，发育为神经组织预定神经母细胞逐渐陷入胚胎内部，发育为神经组织 。位于腹沟前后两端的内胚层细胞也分别内陷，分别形成中肠的前部和后部腹沟前后两端的内胚层细胞也分别内陷，分别形成中肠的前部和后部，两者随后融合形成完整的中肠。在中肠细胞内陷时，在其前后部，两者随后融合形成完整的中肠。在中肠细胞内陷时，在其前后部 同时带人一部分外胚层细胞内陷，分别形成前肠和后肠。随着原肠作用的进行，胚带开始延伸，胚带后端不断向背侧延伸并折向前方。到胚带延伸完成时，。随着原肠作用的进行，胚带开始延伸，胚带后端不断向背侧延伸并折向前方。到胚带延伸完成时， 胚带开始出现分节。胚胎的表皮出现一系列均匀分布的小沟，。胚胎的表皮出现一系列均匀分布的小沟， 将胚胎分为14 个区域 ，此时出现的分节是副体节副体节。副体节与后来的体节在位置上并不对应，每一体节包含前一副体节的后。副体节与后来的体节在位置上并不对应，每一体节包含前一副体节的后2/3 与后一副体节的前1/3。副体节在胚胎发育中的出现是短暂的，但它奠定了胚胎躯体结构划分的基础，也是许多分节基因表达区域的基本单位。大约在。副体节在胚胎发育中的出现是短暂的，但它奠定了胚胎躯体结构划分的基础，也是许多分节基因表达区域的基本单位。大约在7.5 h胚带开始回缩，在这一过程中胚胎开始出现明确的胚带开始回缩，在这一过程中胚胎开始出现明确的 体节 ， 包括3个头部体节，个头部体节，3 个胸部体节，8 个腹部体节和1 个尾节 . 果蝇胚胎大约在受精后24 h 孵出成为幼虫。幼虫要经过两次蜕皮，因此分为。幼虫要经过两次蜕皮，因此分为1 、2 、3 龄幼虫。幼虫表皮具有规则分布的齿状突起带齿状突起带 (denticle belt) ， 这些突起带的形状和大小具有体节特异性，这些是研究果蝇胚胎前一后轴和背这些突起带的形状和大小具有体节特异性，这些是研究果蝇胚胎前一后轴和背-腹轴发育的重要表型依据。果蝇的腹轴发育的重要表型依据。果蝇的3 龄幼虫化成蛹 ， 在激素刺激下发生变态，由幼虫变为成虫。在变态过程中大部分幼虫组织被吸收而被成体结构所代替。果蝇成体的许多结构都是由，由幼虫变为成虫。在变态过程中大部分幼虫组织被吸收而被成体结构所代替。果蝇成体的许多结构都是由 成虫盘 (imaginal disc) 发育而来的，包括发育而来的，包括 腿、翅膀、眼睛、触角及生殖腺 等。成虫盘是在胚胎发育阶段由特定区域的表皮细胞群内陷形成的囊状结构成虫盘是在胚胎发育阶段由特定区域的表皮细胞群内陷形成的囊状结构 。 2. 线虫：秀丽隐杆线虫 (Caenorhabditis elegans)英国科学家Sydney Brenner 在20 世纪60年代开始选择线虫作为发育生物学模式动物，他年代开始选择线虫作为发育生物学模式动物，他 与其合作者H Robert Horvitz 和John ESulston 获得了2002 年的诺贝尔生理学或医学奖。线虫成虫仅年的诺贝尔生理学或医学奖。线虫成虫仅 约1mm 长 ， 构造简单，全身透明，细胞数目少，发育中的，发育中的 细胞谱系 (cell lineage) 几乎固定 ， 易于追踪 。线虫生命周期短，培养简单，便于遗传突变筛选，并可用液氮长期保存生命周期短，培养简单，便于遗传突变筛选，并可用液氮长期保存 。线虫的基因组测序已在1998 年完成( 共含19 099 个基因) ，是第一个完成全基因组测序的多细胞动物，是第一个完成全基因组测序的多细胞动物.线虫 分雌雄同体 和 雄性 两性别，雌雄同体为主要形式.雌雄同体个体的性染色体为雌雄同体个体的性染色体为xx 型 ，而雄性个体为xo 型 ，只一条性染色体.雄体是减数分裂过程中由于染色体丢失造成的 。雌雄同体个体可通过自体受精产生后代，也可与雄性个体交配异体受精。成熟的雌雄同体个体具有雌雄同体个体可通过自体受精产生后代，也可与雄性个体交配异体受精。成熟的雌雄同体个体具有959 个体细胞 ，约2 000个生殖细胞个生殖细胞 。雄虫则有1 031 个体细胞 和约1 000 个生殖细胞. 线虫大致 呈圆柱形 ，外表覆有角质化层，下方为下皮层(hypodermis) ， 然后是肌肉。消化系统包括咽和肠道。其体腔为假体腔，体腔周围没有中胚层细胞包被。然后是肌肉。消化系统包括咽和肠道。其体腔为假体腔，体腔周围没有中胚层细胞包被。雌雄同体 性腺为双臂状， 开口至腹侧中部的阴门。在性腺中，距阴门最近的细胞分化为精子贮存于体内 。卵子细胞核产生于性腺远端，通过减数分裂形成卵子细胞核产生于性腺远端，通过减数分裂形成 ，它们最初以合胞体状态存在最初以合胞体状态存在 ， 直到受精前才形成完整的细胞膜。卵子在产出的过程中受精，在排出母体时通常处于卵裂阶段。卵子在产出的过程中受精，在排出母体时通常处于卵裂阶段 ( 约40 个细胞) 。雄体性腺为 单臂状，只能产生精子。在，只能产生精子。在25 0 C 条件下，线虫 完成一个生命周期约需2.5 天 ( 图绪.9) 。 胚胎的前后轴是由精子人卵处决定的胚胎的前后轴是由精子人卵处决定的，精子入卵的部分成为胚胎的后端。精子入卵引起卵质的重组，受精卵中间部分出现一个，精子入卵的部分成为胚胎的后端。精子入卵引起卵质的重组，受精卵中间部分出现一个 “分裂沟” ， 但此时并不真正分裂，称为“ 假卵裂 ”( pseudocleavage) . 合子卵裂为 不对称卵裂 ( 图绪.10) 第一次卵裂后前部的细胞为AB 细胞 ，而后段的细胞称为P 细胞 。AB 细胞继续分裂为ABa 和ABp 细胞 。 而P细胞后几次的分裂方式则类似干细胞，即每次分裂后都保持其中一个细胞为细胞后几次的分裂方式则类似干细胞，即每次分裂后都保持其中一个细胞为P 细胞,另外一个细胞分别为EMS, C 和D 细胞 ( 图绪.10) 。 P4 细胞是生殖细胞前体细胞是生殖细胞前体 。EMS 细胞继续分裂为一个E 细胞和一个MS 细胞.E细胞将发育为内胚层细胞。线虫胚胎的“原肠作用” 持续时间较长。在。线虫胚胎的“原肠作用” 持续时间较长。在28 细胞时期，两个E细胞开始向内部迁移，此时可以算作是原肠作用的开始。随后由细胞开始向内部迁移，此时可以算作是原肠作用的开始。随后由C 和D 细胞产生的肌细胞 和由ABa 细胞产生的咽细胞也依次由腹裂细胞也依次由腹裂 (ventral cleft) 卷入胚胎内部。胚胎的腹裂相当于胚孔 。腹裂在290 细胞时期合。胚胎在受精后约受精后约14 h 孵化成为幼虫。线虫。线虫 胚胎发育过程中的细胞分裂方式一成不变，其细胞谱系已被完全确定，其细胞谱系已被完全确定 ( 图绪.11). 幼虫经4 次蜕皮成为成体 ，然后在3 天内产下300 多个卵，并在2 周后死亡. 五、发育生物学研究技术( 一) 常用发育生物学研究技术1. 显微镜技术由于胚胎个体通常很小，显微镜和解剖镜仍是发育生物学研究的必备工具。除了常规的光学显微镜外，一些特殊的显微镜也广泛用于发育生物学研究。例如，由于胚胎个体通常很小，显微镜和解剖镜仍是发育生物学研究的必备工具。除了常规的光学显微镜外，一些特殊的显微镜也广泛用于发育生物学研究。例如， 相差显微镜 (phase contrast microscope) 和微分干涉差显微镜 (differential interference. contrast microscope) 适用于观察活的或未染色的样品的精细结构.A. 光镜技术餹 取材、固定、 脱水、 包埋、制片、染色、观察 B. 电镜技术透射电镜术: 取材 、 固定 、 脱水、 包埋 、 制片 、 染色 、观察餹 组织块(lmm 3 ) 用 戊二醛与饿酸两次固定 ， 脱水后树脂包埋 ，用超薄切片机切片用超薄切片机切片 ， 再经醋酸铀和拧橡酸铅染色 。餹 电子束射落到切片时，随细胞构成成分的密度以及吸附重金属铀、铅、饿的程度不同电子束射落到切片时，随细胞构成成分的密度以及吸附重金属铀、铅、饿的程度不同,而发生相应的电子散射。当电子束技射到密度大、吸附重金属多的结构而发生相应的电子散射。当电子束技射到密度大、吸附重金属多的结构( 如溶酶体)时，电子被散射得多，因此，射落到荧光屏上的电子少而呈暗像，电镜照片上呈黑或深灰色，习惯称该结构为时，电子被散射得多，因此，射落到荧光屏上的电子少而呈暗像，电镜照片上呈黑或深灰色，习惯称该结构为 高电子密度；反之呈浅灰色，称低电子密度。；反之呈浅灰色，称低电子密度。扫描电镜术 ： 不需要制备切片，组织块( 约0.3cm 大小) 用戊二醛用戊二醛 和饿酸 固定，经脱水干燥，表面喷镀薄层碳与金属膜，观察. 激光扫描共聚焦显微镜 (laser scanning confocal microscope) 是20世纪世纪80年代初研制成功的一种高光敏度、高分辨率的新型仪器，近年来在发育生物学领域得到了广泛的应用年代初研制成功的一种高光敏度、高分辨率的新型仪器，近年来在发育生物学领域得到了广泛的应用.共聚焦显微镜 是在荧光显微镜基础上发展起来的 。某些荧光物质( 如荧光标记染料或荧光蛋白) 在一定波长的激发光照射下会发出荧光。在一定波长的激发光照射下会发出荧光。 利用荧光染料标记的特异性抗体或探针 ，可对胚胎或细胞中的特定蛋白或可对胚胎或细胞中的特定蛋白或mRNA 的分布进行定性和定量研究。传统的荧光显微镜的最大缺点是成像质量差。共聚焦显微镜技术很好地解决了这一问题。。传统的荧光显微镜的最大缺点是成像质量差。共聚焦显微镜技术很好地解决了这一问题。 2. 组织切片技术餹 要观察到胚胎的内部结构，通常要进行组织切片。餹 最常用的技术是石蜡切片技术。石蜡切片术 (paraffin sectioning) ： 取材 、 固定 、脱水、 包埋、切片包埋、切片 (5 ～10µm 厚)( 连续切片 ）、 贴片、脱蜡、染色、 观察苏木精- 伊红染色法 (hematoxylin-eosin staining， HE 染色法) ： 苏木精为碱性染料，使染色质和核糖体着紫蓝色；伊红为酸性染料使胞质和细胞外基质着红色苏木精为碱性染料，使染色质和核糖体着紫蓝色；伊红为酸性染料使胞质和细胞外基质着红色冷冻切片 是利用特殊的低温包埋剂对样品进行包埋，在低温条件下进行切片的技术。通常冷冻切片的质量比石蜡切片要差，也很难进行连续切片，但是利用特殊的低温包埋剂对样品进行包埋，在低温条件下进行切片的技术。通常冷冻切片的质量比石蜡切片要差，也很难进行连续切片，但 方便快捷,对样品中蛋白质和核酸的保存也较好对样品中蛋白质和核酸的保存也较好 。 特殊染色餹 用 硝酸银将神经细胞染为黑色 (镀银染色法)餹 用 醛复红将弹性纤维和肥大细胞的分泌颗粒染为紫色. .活体染色餹 将无毒或毒性小的染料经静脉注入后，再取材制成切片观察.如注入的将无毒或毒性小的染料经静脉注入后，再取材制成切片观察.如注入的 台盼蓝 (trypan blue) 可被肝、脾器官内的巨噬细胞吞噬.餹 在组织化学术,常使用 荧光染料染色或作为标记物,用荧光显微镜观察或作为标记物,用荧光显微镜观察 3.免疫组织化学 （ （immunohistochemistry） ）根据抗原、抗体特异性结合原理，检测组织切片中的肽和蛋白质用标记的抗体与组织中的抗原结合，标记物可于显微镜下观察根据抗原、抗体特异性结合原理，检测组织切片中的肽和蛋白质用标记的抗体与组织中的抗原结合，标记物可于显微镜下观察。肽和蛋白质均具有抗原性。当把人或动物的某种肽或蛋白质作为抗原注入另一种动物，其体内会产生针对该抗原的特异性抗体(免疫球蛋白)。将抗体从动物血清中提出后，与标记物相结合，即成为。肽和蛋白质均具有抗原性。当把人或动物的某种肽或蛋白质作为抗原注入另一种动物，其体内会产生针对该抗原的特异性抗体(免疫球蛋白)。将抗体从动物血清中提出后，与标记物相结合，即成为 标记抗体。用后者与组织切片孵育，抗体则与组织中相应抗原特异性结合，在显微镜下通过观察标记物而获知该肽或蛋白质的分布部位。。用后者与组织切片孵育，抗体则与组织中相应抗原特异性结合，在显微镜下通过观察标记物而获知该肽或蛋白质的分布部位。标记物有荧光素 （荧光显微镜观察）、 辣根过氧化物酶 （光镜或电镜观察）、（光镜或电镜观察）、 胶体金 （多用于电镜观察） 免疫组织化学(辣根过氧化物酶标记)胰岛B细胞呈胰岛素阳性免疫组织化学(荧光素标记)毛血管内皮细胞呈vWF阳性免疫组织化学(辣根过氧化物酶标记)胰岛B细胞呈胰岛素阳性免疫组织化学(荧光素标记)毛血管内皮细胞呈vWF阳性 4. 分子生物学技术餹 聚合酶链式反应 (polymerase chain reaction ， PCR) ， 反转录PCR (RT ：- PCR) ， Northern 印迹杂交 ，Western 印迹杂交，免疫共沉淀技术等都常用于发育生物学研究，如用于，免疫共沉淀技术等都常用于发育生物学研究，如用于检测目的基因或蛋白质检测目的基因或蛋白质 在某一发育时期或特定组织中的表达。5. 原位杂交技术餹 核酸分子杂交组织化学术， 检测基因 （DNA 片段） 的有无、基因的表达活性的有无、基因的表达活性 （mRNA ） 。餹 原理：用带标记物的已知碱基顺序的核酸探针与细胞内待测核酸用带标记物的已知碱基顺序的核酸探针与细胞内待测核酸 按碱基配对原则 进行特异性原位结合（杂交），并通过对标记物的显示和检测，而获知待测核酸的有无及相对量。，并通过对标记物的显示和检测，而获知待测核酸的有无及相对量。餹 常用标记物有 放射性核素 35 S 、 32 P 、 3 H 和地高辛 6. 显微注射餹 显微注射技术 可将外源DNA 、RNA或标记物等导人早期胚胎细胞中或标记物等导人早期胚胎细胞中 。餹 在 非洲爪瞻和斑马鱼中, 用于对基因功能的研究和细胞谱系的标记研究。用于对基因功能的研究和细胞谱系的标记研究。餹 在 果蝇和小鼠 中，常用于转基因动物的构建.餹 由于 不同动物胚胎大小差异很大，显微注射所需显微操作系统也有所差异。非洲瓜蟾和斑马鱼胚胎可显微注射所需显微操作系统也有所差异。非洲瓜蟾和斑马鱼胚胎可 在解剖镜下操作，而小鼠和果蝇胚胎需操作，而小鼠和果蝇胚胎需 在显微镜下 操作。...