叠氮溴化丙锭-荧光定量PCR法实时快速检测5种乳杆菌活菌数方法的建立与应用
发布时间：2021-08-08 07:42
【背景】乳杆菌属是发酵食品中最常见的微生物之一,与食品的品质和安全密切相关,定量检测乳杆菌活菌数、解析乳杆菌群落组成对发酵乃至肠道微生物等具有重要意义。【目的】建立一种在种水平上定量检测5种乳杆菌活菌数的叠氮溴化丙锭-荧光定量PCR（propidium monoazide-quantitativePCR,PMA-qPCR）检测方法并探讨其适用性。【方法】以植物乳杆菌、发酵乳杆菌、短乳杆菌、嗜酸乳杆菌和干酪乳杆菌等发酵食品中常见的5种乳杆菌为目标菌株,查找并筛选特异性引物用于荧光定量PCR（qPCR）检测,优化叠氮溴化丙锭（PMA）处理条件,测定PMA-qPCR检测法的特异性、灵敏度及可靠性。最后利用PMA-qPCR法检测黄酒酿造过程中5种乳杆菌的活菌数。【结果】PMA最佳处理条件为:浓度20μmol/L下暗处理15 min后曝光15 min,此时可抑制样品中99.89%的死菌DNA扩增。该方法特异性高,能够准确识别5种乳杆菌;线性关系强,R2>0.98;灵敏度高,检测限为101.8-103.2 CFU/mL;重复性好,Cq值变异系数小于1%;与平板计数相比差异不显著（统计学上）,...
【文章来源】：微生物学通报. 2020,47(12)北大核心CSCD
【文章页数】：11 页
【部分图文】：
PMA优化结果
黄酒是一种典型的多菌种混合发酵食品，具有复杂的发酵体系和微生物群落，检测其中的微生物组成，尤其是在种水平上检测乳杆菌的含量具有一定难度。本研究使用建立好的PMA-q PCR检测法在种水平上对黄酒酿造过程中5种乳杆菌的活菌数进行了定量检测。如图4所示，随着发酵时间的延长，黄酒发酵醪液中总乳杆菌的含量从1.2×106 CFU/m L逐渐降低至1.1×105 CFU/m L，与实验室前期高通量测序测得的乳杆菌含量变化趋势[5]相似，较低的乳杆菌含量可能与较低的核酸提取率有关(17.3-35.7 ng/μL)。发酵乳杆菌是黄酒中的优势乳杆菌，占总乳杆菌的25%-45%，尤其是在第3天时，发酵乳杆菌的含量达到了4.95×105 CFU/m L。干酪乳杆菌和短乳杆菌的含量虽然随着发酵时间的延长在不断下降，但其在乳杆菌属中的占比却在不断上升，在发酵第18天时，干酪乳杆菌和短乳杆菌分别占比33.76%和27.93%。植物乳杆菌和嗜酸乳杆菌在黄酒酿造过程中具有较低的含量，仅植物乳杆菌在第3天和第4天具有103.6 CFU/m L和102.9 CFU/m L，而在其他时间点的含量均低于检测限。王然然等[25]通过分离培养的方式从黄酒发酵醪液中筛选到了58株乳杆菌，通过菌种鉴定发现其中34株是发酵乳杆菌，占有绝对优势。Yu等利用PCR-DGGE方法分析了黄酒酿造过程中细菌群落多样性，发现发酵乳杆菌、短乳杆菌和植物乳杆菌在整个发酵过程中都具有较高的丰度[26]，与本文研究结果相似。Lv等采用PMA-q PCR法检测了红曲黄酒中植物乳杆菌的含量，发酵开始阶段(1-5 d)植物乳杆菌的含量约为102.3-102.6 CFU/m L，随后其含量逐渐上升至约106.7 CFU/m L (30 d)，到发酵结束其含量又下降至约106 CFU/m L (45 d)[10]，与本研究结果具有一定差异。酿造环境及工艺的不同可能是导致乳杆菌含量及变化差异的主要原因。图4 PMA-q PCR法检测黄酒酿造过程5种乳杆菌的含量
按照1.2.6的方法评估PMA-q PCR法检测乳杆菌含量的可靠性，结果如图3A所示，Cq值的变异系数均小于1%，表明在实验浓度范围内，该方法具有良好的重复性。t检验证明在103-108 CFU/mL范围内，PMA-q PCR与平板计数法测得的不同乳杆菌的含量在统计学上没有显著性差异(P>0.05)(Lactobacillus fermentum为103 CFU/mL时和Lactobacillus除外)(图3B)。当样品中发酵乳杆菌的含量接近检测限103.2 CFU/mL时，PMA-q PCR的检测准确性出现降低(P<0.05)，尽管如此，其检测结果仍与平板计数检测结果处于同一数量级(表4)。而较差的乳杆菌属定量检测结果反映了以16S rRNA基因为靶基因区域定量检测的局限性，这与16Sr RNA基因在不同乳杆菌基因组DNA中的拷贝数不同有关。通过拷贝数矫正微生物组的丰度对于样品中微生物检测具有重要意义，文献[24]表明通过rrn DB数据库(https://rrndb.umms.med.umich.edu/)可以查找细菌和古菌的16S rRNA基因拷贝数，进而矫正相应拷贝数。2.5 PMA-q PCR检测法在黄酒酿造中的应用
【参考文献】：
期刊论文
[1]T-RFLP和454焦磷酸测序方法分析制麦过程细菌群落的动态变化[J]. 邱然,陆健. 食品与生物技术学报. 2019(04)
[2]黄酒发酵过程中乳酸菌的分离及对其产生物胺能力的评价[J]. 王然然,李晓敏,陈柳,卞小稳,蔡国林,陆健. 食品与发酵工业. 2017(01)
本文编号：3329532
【文章来源】：微生物学通报. 2020,47(12)北大核心CSCD
【文章页数】：11 页
【部分图文】：
PMA优化结果
黄酒是一种典型的多菌种混合发酵食品，具有复杂的发酵体系和微生物群落，检测其中的微生物组成，尤其是在种水平上检测乳杆菌的含量具有一定难度。本研究使用建立好的PMA-q PCR检测法在种水平上对黄酒酿造过程中5种乳杆菌的活菌数进行了定量检测。如图4所示，随着发酵时间的延长，黄酒发酵醪液中总乳杆菌的含量从1.2×106 CFU/m L逐渐降低至1.1×105 CFU/m L，与实验室前期高通量测序测得的乳杆菌含量变化趋势[5]相似，较低的乳杆菌含量可能与较低的核酸提取率有关(17.3-35.7 ng/μL)。发酵乳杆菌是黄酒中的优势乳杆菌，占总乳杆菌的25%-45%，尤其是在第3天时，发酵乳杆菌的含量达到了4.95×105 CFU/m L。干酪乳杆菌和短乳杆菌的含量虽然随着发酵时间的延长在不断下降，但其在乳杆菌属中的占比却在不断上升，在发酵第18天时，干酪乳杆菌和短乳杆菌分别占比33.76%和27.93%。植物乳杆菌和嗜酸乳杆菌在黄酒酿造过程中具有较低的含量，仅植物乳杆菌在第3天和第4天具有103.6 CFU/m L和102.9 CFU/m L，而在其他时间点的含量均低于检测限。王然然等[25]通过分离培养的方式从黄酒发酵醪液中筛选到了58株乳杆菌，通过菌种鉴定发现其中34株是发酵乳杆菌，占有绝对优势。Yu等利用PCR-DGGE方法分析了黄酒酿造过程中细菌群落多样性，发现发酵乳杆菌、短乳杆菌和植物乳杆菌在整个发酵过程中都具有较高的丰度[26]，与本文研究结果相似。Lv等采用PMA-q PCR法检测了红曲黄酒中植物乳杆菌的含量，发酵开始阶段(1-5 d)植物乳杆菌的含量约为102.3-102.6 CFU/m L，随后其含量逐渐上升至约106.7 CFU/m L (30 d)，到发酵结束其含量又下降至约106 CFU/m L (45 d)[10]，与本研究结果具有一定差异。酿造环境及工艺的不同可能是导致乳杆菌含量及变化差异的主要原因。图4 PMA-q PCR法检测黄酒酿造过程5种乳杆菌的含量
按照1.2.6的方法评估PMA-q PCR法检测乳杆菌含量的可靠性，结果如图3A所示，Cq值的变异系数均小于1%，表明在实验浓度范围内，该方法具有良好的重复性。t检验证明在103-108 CFU/mL范围内，PMA-q PCR与平板计数法测得的不同乳杆菌的含量在统计学上没有显著性差异(P>0.05)(Lactobacillus fermentum为103 CFU/mL时和Lactobacillus除外)(图3B)。当样品中发酵乳杆菌的含量接近检测限103.2 CFU/mL时，PMA-q PCR的检测准确性出现降低(P<0.05)，尽管如此，其检测结果仍与平板计数检测结果处于同一数量级(表4)。而较差的乳杆菌属定量检测结果反映了以16S rRNA基因为靶基因区域定量检测的局限性，这与16Sr RNA基因在不同乳杆菌基因组DNA中的拷贝数不同有关。通过拷贝数矫正微生物组的丰度对于样品中微生物检测具有重要意义，文献[24]表明通过rrn DB数据库(https://rrndb.umms.med.umich.edu/)可以查找细菌和古菌的16S rRNA基因拷贝数，进而矫正相应拷贝数。2.5 PMA-q PCR检测法在黄酒酿造中的应用
【参考文献】：
期刊论文
[1]T-RFLP和454焦磷酸测序方法分析制麦过程细菌群落的动态变化[J]. 邱然,陆健. 食品与生物技术学报. 2019(04)
[2]黄酒发酵过程中乳酸菌的分离及对其产生物胺能力的评价[J]. 王然然,李晓敏,陈柳,卞小稳,蔡国林,陆健. 食品与发酵工业. 2017(01)
本文编号：3329532
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