普通牛及其近缘种特异性序列筛选及环介导等温扩增检测方法

发布时间：2021-11-19 07:50

　　近年来,肉制品掺假事件频频发生,亟需建立快速、可靠的肉制品动物源性成分检测方法,保障肉类食品安全。与常规PCR等检测方法相比,环介导等温扩增（loop-mediated isothermal amplification,LAMP）方法具有高特异性、高灵敏度、反应快、易操作等优势。基于此,利用生物信息算法筛选普通牛及其近缘种（牦牛、水牛、美洲野牛）的全基因组序列,以获得种间相似性序列,进而建立并优化可用于检测普通牛及其近缘种成分的特异性LAMP方法。最终优化后的LAMP反应体系为:10μmol·L^-1外引物F3和B3各0.25μL,10μmol·L^-1内引物FIP和BIP各2μL,2 mmol·L^-1 dNTP 2.5μL,25 mmol·L^-1 MgSO₄ 4μL,5 mol·L^-1甜菜碱3.5μL,8.0 U·μL^-1 Bst DNA聚合酶1μL,10×ThermoPol Buffer 2.5μL,DNA模板2μL,加双蒸水至25μ... 

【文章来源】：生物技术进展. 2020,10(06)

【文章页数】：7 页

【部分图文】：

LAMP反应体系和反应温度优化

为了鉴定建立的LAMP方法的灵敏度,以梯度稀释的普通牛及其近缘种DNA为模板,采用优化好的LAMP体系,进行灵敏度分析。灵敏度结果显示(图3):以普通牛的梯度稀释DNA为模板的扩增反应中,在20.000～0.020 ng·μL-1样本中,具有典型的阶梯型条带扩增和绿色的颜色反应,在0.002 ng·μL-1样本中无扩增和颜色变化;以牦牛的梯度稀释DNA为模板的扩增反应中,在20.000～0.200 ng·μL-1为模板的样本中,具有典型的阶梯型条带扩增和绿色的颜色反应,在0.020和0.002 ng·μL-1L样本中无扩增和颜色变化;以水牛的梯度稀释DNA为模板的扩增反应中,在20.000～0.200 ng·μL-1样本中,具有典型的阶梯型条带扩增和绿色的颜色反应,在0.020和0.002 ng·μL-1样本中无扩增和颜色变化;以美洲野牛的梯度稀释DNA为模板的扩增反应中,在20.000～0.020 ng·μL-1样本中,具有典型的阶梯型条带扩增和绿色的颜色反应,在0.002 ng·μL-1样本中无扩增和颜色变化。综合普通牛及其近缘种梯度稀释DNA样品的检测结果,表明建立的LAMP检测方法的灵敏为0.020 ng·μL-1。2.4 实际样品检测

为了验证本研究建立的LAMP方法的实际应用效果,以含有牛、羊、猪、鸡、鸭等不同成分的市售肉制品为模板,进行LAMP扩增。结果显示:在6个含有牛肉成分的样品中扩增获得阶梯型条带,反应颜色从橙色变为绿色;在不含牛肉成分的其余10个样品中无扩增条带,反应颜色为橙色(图4)。实际样品检测结果表明建立的LAMP方法可以用于市售肉及其制品中牛肉成分的检测。3 讨论

【参考文献】：
期刊论文
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本文编号：3504606