应用正交测验法优选巨菌草组培诱导和分化培养基
发布时间：2017-09-15 08:48
摘要
关键词： 正交设计法，优化，组培
Abstract
objective: using orthogonal design method to establish a seed giant JunCao technology system, including the choice of explant and disinfection, formula of culture medium, culture conditions, callus induction and differentiation, rooting seedling, seedling transplanting smelting, etc., by using the optimized transformation system, adopts the method of agrobacterium mediated, turn into cold resistant gene ICE1, explore the giant JunCao system of genetically modified (gm), lay a foundation for giant JunCao genetic improvement.
Keywords: orthogonal design method, optimization and transformation
1 引言
近几年，巨菌草的利用发展很快，已在我国南方大面积栽培，但在北方因无法越冬而推广受到限制。长期以来，巨菌草的品种选育基本上依靠常规育种方法，无法解决巨菌草耐寒性改良的问题。植物基因工程技术的发展为巨菌草的耐寒性遗传改良提供了一种很有潜力的手段。自细胞全能性理论提出以来，在无数科学家的努力下，植物组织培养技术经过近百年的发展历程后已经日趋完善和成熟。单子叶尤其是禾本科植物的组织培养一直是个难点，无论愈伤组织的诱导还是再分化体系的建立，单子叶植物都比双子叶植物困难得多。近几年来禾本科模式植物水稻的农杆菌介导的粳稻遗传转化体系已日趋成熟，为单子叶植物的组织培养和遗传转化提供很好的技术基础。
植物的耐寒基因是由多基因控制的数量性状，因此单独改变某一个或几个耐寒基因对植株耐寒性的提高没多大影响。ICE1基因是在低温时诱导CBF表达的一个转录激活因子，ICE1基因在低温时能特定地结合到CBF3的启动子序列上，诱导CBF3的表达，拟南芥中的CBF3能刺激四十多种胁迫诱导基因的表达，如rd29，cor15A，cor47等（Michael F et al., 2001; Viswanathan C et al., 2003）。Viswanathan C等（2003）已得到了含耐寒基因ICE1的转基因拟南芥植株，与未转基因拟南芥植株相比，转基因拟南芥植株的耐寒能力显著提高。将ICE1基因构建到含强启动子35S的载体中，然后转基因可能培育出耐寒植物品种。
完整的巨菌草组织培养体系和转基因体系是对巨菌草进行遗传改良的前提和技术保障。巨菌草是由福建省福建农林大学菌草研究所所长、菌草技术发明人林占禧研究员于1983年引进中国，经过20多年培育出适合我国气候土壤环境的草种，并由林占禧研究员命名。目前国内未见有关巨菌草组织培养体系和转基因的报道。本研究拟参照其他禾本科植物如水稻、甘蔗等组织培养和遗传转化方法，研究并建立一套完整的巨菌草组织培养体系和转基因体系，为巨菌草的进一步遗传改良提供技术基础，为巨菌草的抗寒育种提供新的途径。
2 材料与方法
2.1材料
2.1.1实验材料
鲜嫩的巨菌草（福建农林大学大学菌草所提供）
2.1.2组培室及各种实验仪器的消毒
（一）植物组织培养室的灭菌
1、地面、墙壁和工作台的灭菌：用2%新洁尔灭喷雾。
（1）配方：取新洁尔灭原液20ml，加水980ml，配成2%新洁尔灭溶液。
（2）方法：将配好的2%新洁尔灭溶液倒入喷雾器内，进行均匀喷雾。
（3）注意事项：
①墙壁、角落、地面喷雾要均匀，不要遗漏；
②注意安全，在喷房顶时，要特别小心，防止药液雾滴掉入眼睛。
2、无菌室和培养室的灭菌：用甲醛和高锰酸钾熏蒸，1年中熏蒸1-2次。
（1）配方：每立方米空间用甲醛10ml加高锰酸钾5g的配比液熏蒸。
（2）方法：首先房子要密封。然后在房子中间放一口缸或大烧杯，将称好的高锰酸钾放入缸内，再把已称量的甲醛溶液慢慢倒入缸内，完毕，人迅速离开，并关上门，密封3天。
（3）注意事项：
①操作前要戴好口罩及手套；
②倒入甲醛时要小心，因为甲醛遇到高锰酸钾会迅速沸腾，并产生大量烟雾。操作时人要迅速避开烟雾；
③3天后，打开房间，搬走费液缸；一周后，方可进入操作。
3、在已经熏蒸过的房间内，用70%酒精纱布擦洗培养架、工作台。
4、用紫外灯照射20—30min。
5、使用前，再用70%酒精喷雾，使空间灰尘落下。
（二）培养基的灭菌——高压蒸汽灭菌（湿热灭菌法）
（1）洗涤：把组织培养基用的培养皿、三角瓶、试管等玻璃器皿进行彻底清洗。自然晾干或烘箱干燥。
（2）包扎：用牛皮纸、报纸、纱布或锡箔纸把玻璃器皿和金属器械分别包扎好。
（3）装水：在高压灭菌锅内装入一定量的水（水要淹没电热丝）。（切忌干烧！）
（4）装物品：在灭菌锅内放入含培养基的培养瓶或三角瓶、装蒸馏水的玻璃瓶，以及包扎好的玻璃器皿和金属器械等。
（5）灭菌：将排气阀开着，加热，直至锅内释放出大量水蒸气（此时水蒸气横向喷出），再关闭阀们；或者当锅内压力升至49.0KPa时，开启排气阀，将锅内的冷空气全部排出。当锅内压力达到108KPa时，温度为121℃时，维持15-20分钟，即可达到灭菌的目的。（若灭菌时间过长，会使培养基中的某些成分变性失效。）切断电源，让灭菌锅自然冷却。
注意：①先打开放气阀，再打开锅盖。（以免锅内压力大而爆炸！）
②开盖后应尽快转移培养瓶，使培养瓶冷却、凝固。一般应将灭菌后的培养瓶储藏于30℃以下的室内，最好储藏在4-10℃的条件下。
③某些生长调节剂如IAA、ZT、ABA等以及某些维生素遇热是不稳定的，不能同培养基一起高压灭菌，而需要进行过滤灭菌。
2.1.3外植体的准备及消毒
选取幼嫩且生长良好的狼尾草茎秆，剥除叶鞘，用刀割下腋芽和顶芽 ( 注意尽量减少对腋芽的损害) ，将腋芽和顶芽置于纱布中，乙醇清洗→无菌水清洗→2%NaClO 浸泡10分钟→无菌水清洗三到四次。
2.1.4培养基的制备
将以下各成分混合，定容至 1000mL，调 pH至 5. 8，见表 1。
按 20mL/瓶分装到加有激素的三角瓶中，121℃，灭菌 20min，备用。
3 采用不同防褐化物质对愈伤组织诱导的影响
很多种类的植物体中含有大量多酚类化合物，切取芽时的创伤会激活组织中的多酚氧化酶，将多酚类物质氧化为棕褐色的醌类物质，使外植体的切口处发生褐变，并会渗透到培养基中，使培养基褐化，其结果是严重影响培养物的生长和分化，甚至造成培养物死亡。
影响褐变的因素很多，植物的种类褐基因型、外植体的来源和生理状况以及培养基的成分都会不同程度的影响褐变的程度。一般木本植物的外植体比较容易产生褐变现象，在成年树尤其严重。培养基中含酚过高会导致褐变，含过高浓度的无机盐和肌醇也会加剧外植体的褐变。6-苄氨基嘌呤（6-BA）和激动素（KT）也有诱导褐化的作用。强光和高温同样会促进褐化现象。
为了防止外植体的褐变，我们采用不同浓度的AC，PVP等防褐化物质在
相同培养基的情况下观察出愈率。如表1
表1
处理 基本培养基 防褐化物质 浓度
（mg/L) 出愈率 5%显著水平 1%极显
著水平
III1 MS+2,4-D+NAA+KT AC 0.1 2.96% c B
III2 MS+2,4-D+NAA+KT AC 0.2 1.85% c B
III3 MS+2,4-D+NAA+KT AC 0.3 4.81% c B
III4 MS+2,4-D+NAA+KT PVP 0.5 58.52% b A
III5 MS+2,4-D+NAA+KT PVP 1.0 76.30% a A
III6 MS+2,4-D+NAA+KT PVP 1.5 55.93% ab A
4 正交测验
正交试验设计是研究多因素多水平的又一种设计方法它是根据正交性从全面试验中挑选出部分有代表性的点进行试验这些有代表性的点具备了“均匀分散齐整可比”的特点正交试验设计是分析因式设计的主要方法是一种高效率、快速、经济的实验设计方法。
激素对植物生长影响很大，激素浓度是组织培养研究的关键环节，我们采用了 2,4-D、KT 和NAA 作为巨菌草外植体诱导的组合，并研究了不同浓度的激素组合对外植体的生长情况的影响
基本培养基： MS
三因素：2,4-D 浓度：A1（1.0mg/）, A2（2.0mg/L）, A3（3.0mg/L）
NAA浓度：B1（0.1mg/L）, B2（0.2mg/L）, B3（0.3mg/L）
KT浓度：C1（0.5mg/L）, C2（1.0mg/L）, C3（1.5mg/L）,
采用L9(34)设计。组合搭配：
A1B1C1 A1B2C2 A1B3C3
A2B1C2 A2B2C3 A2B3C1
A3B1C3 A3B2C1 A3B3C2
共9个处理每个处理接3瓶，每瓶5块外植体，3次生物学重复（时间重复），统计愈伤率，方差分析，差异显著性测验，确定最佳激素组合。
表1 L9(33)正交表
处理号 1 2 3
1 1 1 1
2 1 2 2
3 1 3 3
4 2 2 1
5 2 3 2
6 2 1 3
7 3 3 1
8 3 1 2
9 3 2 3
表2 正交实验设计巨菌草愈伤组织诱导结果
处理编号 基本培养基 2,4-D（mg/L) IAA（mg/L) KT（mg/L) 出愈率 0.05 0.01
I1 MS 1.0 0.1 0.5 14.81% cd BCD
I2 MS 1.0 0.2 1.0 70.37% a A
I3 MS 1.0 0.3 1.5 11.11% d CD
I4 MS 2.0 0.2 0.5 31.48% b B
I5 MS 2.0 0.3 1.0 27.78% bc BC
I6 MS 2.0 0.1 1.5 27.78% bc BC
I7 MS 3.0 0.3 0.5 7.41% d D
I8 MS 3.0 0.1 1.0 18.52% bcd BCD
I9 MS 3.0 0.2 1.5 18.52% bcd BCD
表3 方差分析
变异来源 平方和 自由度 均方 F值
区组 0.0144 2 0.0072
2,4-D 0.1529 2 0.0765 11.8942
IAA 0.3073 2 0.1536 23.8982
KT 0.2496 2 0.1248 19.4145
误差 0.1029 16 0.0064
总和 0.9588
图1 巨菌草幼茎愈伤组织
5 不同培养基对巨菌草愈伤组织诱导的影响
培养基（Medium）是供微生物、植物和动物组织生长和维持用的人工配制的养料，一般都含有碳水化合物、含氮物质、无机盐（包括微量元素）以及生长素和水等。有的培养基还含有抗菌素、色素、激素和血清。本实验采用四种不同的培养基MS，B5，N6，NB来反映不同的培养基对巨菌草组织又到的影响。
处理 基本培养基 激素
1 MS 2,4-D + NAA + KT
2 B5 2,4-D + NAA + KT
3 N6 2,4-D + NAA + KT
4 NB 2,4-D + NAA + KT
共4个处理，每个处理接3瓶，每瓶5块外植体，3次生物学重复（时间重复），统计愈伤率，方差分析，差异显著性测验，确定最佳激素组合。
表4
处理 基本培养基 激素 出愈率 5%显著水平 1%极显著水平
II1 MS 2,4-D（1.0mg/L) + NAA (0.2mg/L)+ KT(1.0mg/L) 66.67% a A
II2 B5 2,4-D（1.0mg/L) + NAA (0.2mg/L)+ KT(1.0mg/L) 52.96% ab AB
II3 N6 2,4-D（1.0mg/L) + NAA (0.2mg/L)+ KT(1.0mg/L) 37.78% bc B
II4 NB 2,4-D（1.0mg/L) + NAA (0.2mg/L)+ KT(1.0mg/L) 27.78% c B
6 结果与分析
植物组织培养过程中，外植体消毒处理难，易污染是最常见的问题。我们以巨菌草腋芽、顶芽作为外植体，研究了不同的消毒处理以及不同的消毒时间对外植体染菌量的影响。通过对外植体消毒的实验可以发现，绝大部分大的腋芽都染菌了; 经过 75% 乙醇处理的幼嫩外植体都褐化比较严重，生长活力比较低，部分幼芽可能死亡，可能是酒精浓度过高外植体比较嫩的原因; 从实验结果看，对小嫩芽和顶芽的消毒不需要用酒精处理，只用2%次氯酸钠处理 10min 左右比较好，对于比较大的腋芽，则需要先使用酒精处理，次氯酸钠的浓度也可以适当提高一些，尽量避免交叉污染。在植物组织培养中，外植体接种成功与否，主要取决于外植体的选取和消毒时间。当消毒时间超过一定程度时就会出现接种材料致死而变黑的现象，导致染菌率升高和成苗率降低。酒精溶液有很强的穿透力，一般消毒时间应控制在2min 以内。在生产上应对外植体进行彻底消毒并执行严格的无菌操作，尽可能多地获得无菌外植体，为建立起初次培养无菌体系奠定基础。组织培养快速繁殖省去了诱导愈伤组织步骤，直接诱导芽分化，大大缩短了诱导时间，而且可以减少种苗变异率。通过巨菌草不同激素及浓度组合后外植体的生长情况 。可以发现结果部分符合理论以及前人在无菌外植体建立实验中的结果，即高浓度的细胞分裂素有利于芽的生长。
7 讨论
8 结论
参考文献
致 谢
在论文完成之际，我要特别感谢我的指导老师郑燕老师的热情关怀和悉心指导。在我撰写论文的过程中，老师倾注了大量的心血和汗水，无论是在论文的选题、构思和资料的收集方面，还是在论文的研究方法以及成文定稿方面，我都得到了老师悉心细致的教诲和无私的帮助，特别是他广博的学识、深厚的学术素养、严谨的治学精神和一丝不苟的工作作风使我终生受益，在此表示真诚地感谢和深深的谢意。 在论文的写作过程中，也得到了许多同学的宝贵建议，同时还到许多在工作过程中许多同事的支持和帮助，在此一并致以诚挚的谢意。 感谢所有关心、支持、帮助过我的良师益友。 最后，向在百忙中抽出时间对本文进行评审并提出宝贵意见的各位专家表示衷心地感谢！
作者：
2014年4月 30日
本文编号：855525
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