螺旋环螺旋结构域扩散激酶(CHUK)基因与中风中医证型及其炎性反应的关联研究

发布时间：2017-09-19 14:22

缺血性脑卒中在中医称“中风”｡中医学认为中医证型具有分子遗传基础,既往研究表明,基因的差异表达及基因序列的多态性决定了个体的差异,在临床则表现为不同的证候群｡螺旋环螺旋结构域扩散激酶(conserved helix-loop-helixubiquitous kinase,CHUK)基因编码的蛋白质是核因子NF-kappa-B复合物的抑制剂,可影响NF-kappa-B通路的活性,有研究表明NF-kappa-B通路参与脑卒中的病理过程[3],因此,CHUK基因可能参与脑卒中的病理过程｡本研究旨在分析CHUK基因在不同中风患者与对照组中的表达差异,并探讨CHUK基因多态性位点(rs3808916､rs2230804､rs3808917)与中风证型及炎性反应的关联性｡

一､资料

1.资料来源

病例需同时符合西医诊断标准和中医诊断标准｡病例组来自于2009年7月至2014年6月在广西中医药大学第一附属医院中医脑病科住院的缺血性中风患者｡对照组来自同期的广西中医药大学第一附属医院体检中心参加健康体检的正常人以及骨科等患非神经系统疾病且病情较轻微的住院患者｡

2.诊断标准
西医诊断标准:参照1995年全国第四届脑血管病学术会议修订的《各类脑血管病诊断要点》缺血性脑卒中诊断,均经头颅CT和/或MRI确诊,每个病例均经过至少2名主治以上职称的神经内科医师诊断一致｡
中医诊断标准及证候辨证分型标准:依据1996年国家中医药管理局全国脑病急症科研协作组制订的《中风病诊断疗效评定标准(试行)》｡每例缺血性中风患者均经2名经统一培训的主治以上职称的中医医师进行中医证候分型,若2名中医医师辨证结果不一致,则提交由3名副高以上职称的中医医师组成的专家小组讨论后确定中医证候类型｡
本研究选择风痰瘀阻证､气虚血瘀证这两个临床上常见的中风证型进行研究,风痰瘀阻证诊断标准为:半身不遂,口舌歪斜,言语蹇涩或不语,感觉减退或消失,头晕目眩,痰多而黏,舌质暗淡,舌苔薄白或白腻,脉弦滑｡气虚血瘀证诊断标准为:半身不遂,口舌歪斜,言语蹇涩或不语,感觉减退或消失,面色胱白,气短乏力,自汗出,舌质暗淡,舌苔白腻或有齿痕,脉沉细｡

3.排除标准
病例组排除肿瘤､脑外伤､脑血管畸形以及心脏源性栓塞等其他原因引起的缺血性中风;合并自身免疫性疾病等严重系统性疾病者;严重心､肝､肾功能障碍｡对照组排除合并自身免疫性疾病等严重系统性疾病者;存在严重心､肝､肾功能障碍者;体检前2周有感染､发热等炎性疾病者｡

4.研究对象
共纳入缺血性中风595例,包括:风痰瘀阻证311例,平均年龄(64.46±10.90)岁;气虚血瘀证284例,平均年龄(66.99±10.45)岁｡纳入对照605例,平均年龄(65.56±12.45)岁｡风痰瘀阻证患者与对照组在性别､年龄上的差异均无统计学意义,气虚血瘀证与对照组在性别､年龄上的差异亦无统计学意义｡所有对象均自我报告为广西汉族人,相互之间无亲缘关系,且均知情同意｡


二､方法

1.实时荧光定量PCR(qRT-PCR)
抽取研究对象外周静脉血2mL,置于枸橼酸抗凝管内,于采血后6h内分离血清及血细胞(3 000r/min,离心10min),血清放置于-80℃冰箱保存以备用于炎性细胞因子血清水平测定｡采用Trizol法(美国Invitrogen公司提供)提取外周血单核细胞中总RNA,使用PrimeScriptTM RT reagent Kit With gDNA Eraser(TaKaRa)试剂盒进行逆转录｡
本研究以GAPDH为管家基因,管家基因上游引物序列5’-GGT GGT CTC CTC TGA CTT CAA CA-3’下游引物序列5’-GTT GCT GTA GCC AAA TTC GTT GT-3’;CHUK基因为目的基因,上游引物序列为5’-TGC CTT GGC CAT TTA AGCACT A-3’下游引物序列5’-GGG ACA GTG AAC AAG TGACAA CTC-3’｡
管家基因GAPDH和目的基因CHUK引物设计由Primer Premier5软件设计并由上海生工生物工程股份有限公司合成｡采用SYBRR Premix Ex TaqTMⅡ试剂盒(大连TAKARA公司提供)和BIO-RAD伯乐CFX96仪器按照实验步骤实行实时荧光定量PCR(qRT-PCR)测定CHUK基因mRNA表达水平｡
RT-PCR反应体系(总体系为20.0μL)构建如下:SYPR PremixEx Taq:10.0μL;上游引物:0.4μL;下游引物:0.4μL;cDNA模板:2μL;ddH 2 O:7.2μL｡PCR反应条件如下:95℃30s;95℃5s;60℃30min,40循环｡GAPDH和CHUK在健康对照和缺血性脑卒中的表达水平是通过2-detadetaCT计算,共完成36例缺血性中风风痰瘀阻证､37例气虚血瘀证､85例对照的外周血CHUK基因mRNA表达水平测定及数据分析｡

2.基因分型检测
采集研究对象外周静脉血2mL,置于EDTA管内,混匀,4℃保存,于7d内完成DNA提取｡采用北京天根科技有限公司生产的血液基因组DNA提取试剂盒[TIANampBlood DNA Kit(离心柱形)],严格按照产品说明书操作步骤进行血液基因组DNA的提取,并分装为3管,放置于-80℃保存备用｡采用北京博淼生物公司的Sequenom MassARRAY iPLEX实验平台进行基因分型｡

3.炎性细胞因子血清水平测定
炎性细胞细胞因子测定的血清样本与RT-PCR的样本来自于同一研究对象｡运用酶联免疫吸附实验(ELISA)技术检测5个炎性细胞因子(IL-1b,IL-6,IL-8,IL-12,TNF-α)的血清含量,采用Raybiotech公司QAH-TH17-1试剂盒进行同步检测｡共完成42例气虚血瘀证､100例对照的炎性细胞因子表达水平测定及数据分析｡

4.统计学方法

采用PLINK软件进行基因型与表型的遗传关联分析｡采用拟和优度卡方检验进行HWE平衡分析｡以比值比(OR)及其95%可信区间表示相对危险度｡采用linearregression分析各位点多态性与数量性状的关联｡运用QAH-TH17-1的数据分析软件来进行细胞因子数据分析｡其它数据的统计分析使用SPSS 16.0统计软件包:计数资料组间比较采用χ2检验,计量资料的两组间比较采用独立样本t检验(正态分布)或者秩和检验(非正态分布)｡所有统计学检验均为双侧检验,以P<0.05为差异有统计学意义｡

三､结果

1.CHUK基因表达水平测定
中风风痰瘀阻证患者的CHUK基因表达水平显著高于对照组(P<0.01),气虚血瘀证患者的CHUK基因表达水平也显著高于对照组(P<0.01),差异具有统计学意义｡

2.CHUK基因多态性位点的Hardy-Weinberg Equilibrium(HWE)分析以及基因型分布比较
拟和优度卡方检验结果显示,CHUK基因的3位点在风痰瘀阻证(rs3808916:T/T 7例､T/C 90例､C/C 214例;rs2230804:G/G 62例､G/A 166例､A/A 83例;rs3808917:A/A 30例､A/C 135例､C/C 146例)和气虚血瘀证(rs3808916:T/T 6例､T/C 79例､C/C 199例;rs2230804:G/G58例､G/A 141例､A/A 85例;rs3808917:A/A 25例､A/C 132例､C/C 127例)患者中,基因型分布均符合HWE平衡定律(均为P>0.050)｡

3.CHUK基因多态性与缺血性中风不同证型易感性的关联分析
CHUK基因的3个SNPs(rs3808916,rs2230804,rs3808917)多态性与缺血性中风风痰瘀阻证的易感性均无统计学关联,而且,这3个SNPs与气虚血瘀证易感性的关联也无统计学意义｡

4.CHUK基因多态性与缺血性中风不同证型患者炎性细胞因子血清水平的关联分析
气虚血瘀证:rs2230804位点AA基因型携带者的IL-8､TNF-α血清含量均显著低于GG+GA基因型携带者(P<0.05,P<0.01),见图2､图3｡rs3808917位点AA基因型携带者的TNF-α血清含量显著低于CC+CA基因型携带者,差异具有统计学意义(P<0.01),见图4｡但在风痰瘀阻证中,3个位点不同基因型携带者之间的与所有测定的炎性细胞因子水平均无统计学差异｡

5.缺血性中风气虚血瘀证患者与对照组的炎性细胞因子血清水平的比较

气虚血瘀证患者IL-8和TNF-α血清含量显著高于对照组,差异具有统计学意义(P<0.001)｡

四､讨论

缺血性中风属中医学“中风”范畴,其主要病机为本虚标实,即以气虚､阴虚为本,风､火､痰､瘀为标｡中医医家认为中风病因为大率多痰,在左属死血瘀,在右属痰有热,并气虚｡或因虚生风化痰,因虚致瘀,最后致痰瘀阻络,发为中风,因此,痰浊瘀血阻络被认为是中风发生的最直接的病机｡有学者指出痰浊瘀血与动脉粥样硬化有关,而炎性反应是脑动脉粥样硬化的主要致病因素｡中医学“风痰瘀阻证”与“气虚血瘀证”与现代医学中的炎性反应存在相关的生物学基础｡
CHUK基因编码核因子NF-kappa-B复合物的一种抑制剂,其编码的蛋白可使NF-kappa-B信号通路上的节点磷酸化,从而激活核录因子NF-kappa-B,最终促进成套促炎基因的表达,进而促进了动脉粥样硬化形成｡
本研究发现CHUK基因在中风风痰瘀阻证､气虚血瘀证及对照组中均有表达,且在两个证型中的表达量较对照组均显著升高,表明CHUK基因mRNA可能参与了中风风痰瘀阻证､气虚血瘀证的发生机制｡与本研究结果相似的是,既往研究也发现了一些与中医证型发生发展相关的差异表达基因｡张家仕报道冠心病痰浊证､气虚血瘀证患者的MiRNA-499基因表达水平均显著高于对照,表明MiRNA-499基因mRNA影响冠心病中医证型的发生发展｡陆瑞敏等发现,糖尿病动脉粥样硬化气虚血瘀证患者的单核细胞COX-2 mRNA表达水平较健康对照组显著偏高,说明COX-2基因mRNA影响糖尿病动脉粥样硬化患者气虚血瘀证的发生｡上述研究表明,易感基因mRNA表达水平影响中医证型的发生,提示中医辨证分型具有分子生物学基础｡
我们进一步探索CHUK基因遗传多态性对于中风证型发生风险及炎性反应的影响｡我们的研究未观察到CHUK基因多态性(rs3808916,rs2230804,rs3808917)与中风风痰瘀阻证､气虚血瘀证发生风险显著关联｡但是,本研究发现,rs2230804多态性影响气虚血瘀证患者的IL-8､TNF-α血清含量,而rs3808917亦影响气虚血瘀证患者的TNF-α血清表达水平,表明CHUK基因多态性可能参与中风气虚血瘀证的炎性反应过程｡Parreira J等发现在中风患者TNF-β基因rs909253TNFB2等位基因携带者血清中TNF-α水平较其他基因型携带者显著升高;Ayhan等在支气管扩张的研究中也发现IL-8基因的-251A/T基因型携带者血清中IL-8水平较其他基因型携带者显著升高｡这些研究提示基因多态性可能影响细胞因子水平｡
另外,在炎性细胞因子与中医证型的研究中,王永炎院士提出“毒损脑络”概念,其中“毒”包含有“痰”“瘀”,这概念对应现代医学“炎性反应”,即痰､瘀积聚致病与中风血栓形成后炎性因子表达致神经损伤相一致｡
本研究观察到IL-8和TNF-α在气虚血瘀证患者的血清含量显著高于对照组,与本结果一致的是尚丽霞等发现

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本文编号：882136