海藻酸钠与碱土金属离子的络合机理研究

发布时间：2016-05-06 14:34

第 1 章 前言

1.1 研究背景
亲水胶体通常是指具有良好的亲水性的大分子物质，该类分子能充分溶解于水，形成透明、滑腻、粘稠、类似胶状的物质，可有效改善食品体系的质地、结构和稳定性[1,2]。亲水胶体在自然界分布广泛，主要分为蛋白和多糖两大类，其中多糖占绝大多数，如植物多糖、动物多糖、微生物多糖及改性多糖分子[2,3]。多糖是亲水胶体的重要组成部分，植物茎块、果实的分泌物和提取物（如海藻酸钠），一些微生物的代谢产物（如黄原胶），以及天然大分子化学改性后的产物（如变性淀粉）[1,2]都属于亲水胶体。亲水胶体具有良好的乳化性、增稠性、持水性和稳定性，不仅在化妆品、食品、纺织印染等传统工业得到广泛应用，还被广泛应用于医学、制药、环境治理和生物技术等新兴技术领域。随着生活水平的提高，人们逐渐认识到了健康食品的重要性，高纤维、低脂肪的新型食品越来越多地受到人们的青睐。大量研究表明，亲水胶体可以作为一种可溶性膳食纤维降低人体内血清胆固醇的含量，缓解糖尿病人的症状等。亲水胶体作为脂肪替代品在食品中的应用已经越来越广泛，全世界每年的产值大概在44亿美元，并且还在不断地增加中[3]。

海藻酸钠和果胶是重要的亲水胶体，由于它们具有良好的凝胶性能和广泛的应用前景，学者们对其研究从未间断。海藻酸钠作为可食用但几乎不被人体消化吸收的高分子多糖，能够降低血清和肝脏中的胆固醇，它在胃肠道中具有吸收重金属离子，凝胶过滤等作用，有助于清除体内的重金属离子[4]。果胶是一种非淀粉多糖的水溶性膳食纤维，具有无毒、可生物降解、来源广泛等优点，已被广泛用作胶凝剂、增稠剂、乳化剂和稳定剂等[5]。

1.2 海藻酸钠概论
海藻酸钠是褐藻结构的组成成分和土壤中细菌的荚膜多糖，在自然界中含量十分丰富，全世界每年的产量大概为 3 万吨，其中有 30%用于食品工业，剩下的用于其它工业[6]。我国有着丰富的海洋资源，褐藻的加工产量名列世界前茅，但是在褐藻的深加工方面却落后于其它国家，因此我国已把褐藻精深加工技术，特别是海藻酸钠的精加工及其应用研究列入海洋领域的 863 研究和规划中。海藻酸钠除了应用于传统的食品、纺织等轻工业，还由于其显著的抗癌、抗氧化、抗辐射、调节免疫、降低血糖等功能，被广泛应用于生物医药等行业[7~10]。
1.2.1 海藻酸钠的结构与性质

海藻酸钠是一种碳水化合物，是由直链型（1→4）键合的 β-D-甘露糖醛酸（Mannuronic acid，M）与 α-L-古洛糖醛酸（Guluronic acid，G）形成的共聚物[11]。1964-1966 年，Haug[12~14]等人第一次提出了海藻酸钠的结构，他们采用水解和分离的方法把海藻酸钠分为三种完全不同的组分，其中两种分别是由聚古洛糖醛酸（M）和聚甘露糖醛酸（G）组成，另外一部分是由大量 MG 二聚体组成。他们认为海藻酸钠是由 M 嵌段和 G 嵌段共聚形成的。后人在他们的基础之上做了大量的研究，对海藻酸钠的分子结构有了十分详细的认识，其结构图如图 1-1 所示[6]：

1.2.2 海藻酸钠的研究现状
目前仍有不少学者不断地研究海藻酸钠与阳离子的络合机理和凝胶化行为。挪威生物高分子实验室NOBIPOL的Draget和Stokke等人利用小角度X射线散射和流变学研究了海藻酸钠与Ca2+的络合机理、凝胶行为以及凝胶结构与性质之间的关系。他们发现在Ca2+浓度较低时，分子主要形成“蛋盒”模型二聚体，在Ca2+浓度较高时，会生成大量横向交联的多聚体[20,21]。同时他们在海藻酸钠、G嵌段与钙离子的混合凝胶研究中发现，在相同的钙离子浓度条件下，其凝胶强度要小于海藻酸钠与钙离子的络合。这是由于短链的G嵌段会在钙离子的作用下与海藻酸钠中的G嵌段络合，这种结合不会增加其凝胶强度，但由于一部分的钙离子被G嵌段占据，导致与海藻酸钠络合的钙离子减少，从而使凝胶强度减弱[22]。
Trieste 大学的 Donati 等人[23]利用酶对海藻酸钠进行定向酶解，制得不同精细结构（G/M 比率、嵌段信息）的海藻酸钠，并以此研究了二价金属离子与不同嵌段结构的络合行为。结果表明：Ba2+可以与 G 嵌段和 M 嵌段络合，Ca2+可以与 G嵌段和 MG 嵌段络合，而 Sr2+只能络合 G 嵌段。Donati 等人[24]还利用荧光标记和圆二色谱等手段对海藻酸钠最初形成的单体复合物进行了研究，提出了一种倾斜的“蛋盒”模型。他们认为“蛋盒”模型并不只是在第二步骤中形成，而在第一步骤中会形成一种倾斜的“蛋盒”模型，但是这种“蛋盒”模型并不稳定。
Funami[86]对海藻酸钠与钙离子溶液凝胶性质进行研究，发现在钙离子存在下，海藻酸钠的微凝胶性质是由结构一致性或分子组装后的机械强度控制的。尽管有文献报道，海藻酸钠中 G 单元是其形成离子凝胶的重要组成部分，大量结合的钙离子并不是体系粘弹性较好的因素，表明 G 单元中蛋盒模型二聚体并不是影响凝胶的唯一因素，海藻酸钠的嵌段信息和钙离子是影响其凝胶方式的重要因素。

此外，国内的学者也对海藻酸钠进行了大量研究。华南理工大学的童真教授[25]研究了不同分子量、分子量分布和 M/G 比值的海藻酸钠样品在不同浓度下的动态粘弹性，结果表明，海藻酸钠水溶液的凝胶转变过程遵循 Winter 方程，凝胶结构具有自相似性，凝胶化点处的凝胶交联结构与海藻酸钠的分子量有关，短分子链海藻酸钠交联的交联点比长分子量链要少，对弹性的贡献少。同时，他们[25]也研究了钙离子、铜离子与不同分子量的海藻酸钠的临界凝胶行为，得出了分子量小的海藻酸钠与钙离子、铜离子络合的临界指数符合逾渗模型的预测值，与海藻酸钠浓度无关，属于生长型凝胶化；而分子量大的海藻酸钠的临界指数与逾渗模型的预测不一致，属于交联型凝胶化。清华大学的冯庆玲等人[26]研究出一种特殊的方法使无机离子和有机添加剂缓慢且持续结合，用来模拟有机物的生物矿化作用。他们用扫描电镜（SEM）和 X 射线衍射（XRD）来研究海藻酸钠对碳酸钙晶体形成的影响。发现单个碳酸钙晶体和球型碳酸钙聚集体是方解石主要两种形态，晶体的大小、形态和表面粗糙度是由海藻酸钠中 G 嵌段的长度来决定的。傅氏转换红外线光谱分析仪（FTIR）和热重分析仪（TGA）揭示了矿化作用过程中矿物和生物大分子之间的相互作用，在海藻酸钠和矿物之间有着化学相互作用，这些作用可能是海藻酸钠的羧基和矿物中的钙离子发生的。同时提出了一种海藻酸钙水凝胶对碳酸钙晶体形成的抑制机理。高 G 含量和低 G 含量的海藻酸钙水凝胶分别诱导形成双球性晶体结晶聚集体和单球性晶体聚集体。从而实现了对碳酸钙晶体的晶体形状，尺寸大小和形貌的控制。

第 2 章 海藻酸钠的分子表征

2.1 引言

本章利用凝胶渗透色谱-多角度激光光散射仪（GPC-MALLS）测定海藻酸钠分子量及分子量分布，利用粘度法测量海藻酸钠的固有粘度，利用核磁共振波谱仪（NMR）来测定海藻酸钠的古洛糖醛酸（G）、甘露糖醛酸（M）的含量及嵌段信息，从而得到海藻酸钠的精确分子信息。

2.2 实验材料与仪器设备
流动相配制：用超纯水配制浓度为 0.1 M 的 NaCl 水溶液，向其添加 0.03%（w/w）NaN3以防止微生物的生长。然后用真空泵抽滤三次，微孔滤膜直径为 0.22μm。置于超声机中超声除去气泡后作流动相备用。
海藻酸钠样品配制：准确称取一定量的海藻酸钠溶于流动相中，使海藻酸钠溶液终浓度为 0.5 mg/ mL，置于滚轴混合器上过夜摇匀备用。
GPC-MALLS分析系统由Shodex OHpak SB-G型保护柱、Shodex OHpak SB-805型分离柱、Waters 515 HPLC 型泵和检测器组成。检测器由 DAWN HELEOS 型多角度激光光散射仪（激光波长 658 nm）、SPD-10Avp 型紫外检测器（检测波长 214nm）和 Optilab rEX 型示差折光检测器（激光波长 658 nm）组成。进样前样品用0.45 μm的尼龙滤膜过滤，进样量为200 μL，流速为0.5 mL/ min，实验温度为25 ℃。海藻酸钠的 dn/dc 值为 0.150 mL/g[67]。
从图 2-1 中可以看出，三种海藻酸钠的 RI 和 UV 信号显示出两个信号峰，峰尖位置分别在 8 mL 和 12 mL 附近，而 LS 只有一个峰，峰尖位置在 8 mL 附近。在洗脱体积为 8 mL 时，LS 与 RI 都有很强的信号，而 UV 信号值很小，表示此物质含量多，分子量较大，蛋白含量很小，此物质应为海藻酸钠；在洗脱体积为 12 mL时，UV 有很强的信号，而 RI 信号值很小，LS 基本无信号，表示此处物质含量少，分子量较小，此物质可能为其它小分子物质。由图 2-1 可知三种海藻酸钠的成分很接近。
由于海藻酸钠的凝胶性能主要取决于古洛糖醛酸（G）的含量，由表 2-3 可知DMB样品的G单元含量为67.6%，远大于DM样品和Sigma样品的35.8%和33.6%。表明 DMB 样品与阳离子络合能力要远大于 DM 样品和 Sigma 样品。海藻酸钠与阳离子形成离子凝胶时，G 嵌段的平均长度决定了海藻酸钠离子凝胶的强度[72]，DMB样品的G嵌段平均长度为22.0，远大于DM样品和Sigma样品的4.26和3.12，可能 DMB 样品的凝胶性能要大于 DM 样品和 Sigma 样品。

图 3-1 是三种海藻酸钠与钙离子络合时归一化相对粘度的变化。由图 3-1（a）可以看出，当 DM 浓度为 0.025%时，随着 R 值的增加，归一化相对粘度基本保持不变，这可能是因为 DM 浓度太低，络合反应不明显；当 DM 浓度为 0.030%、0.040%和 0.050%时，归一化相对粘度随着 R 值的增加呈现出先下降后升高再下降的趋势，络合反应呈现出三步骤，分子尺寸呈现出先减小后增大再减小的趋势；当 DM 浓度为 0.075%和 0.100%时，此时由于 DM 浓度较大，会形成微凝胶，堵塞乌氏粘度计的毛细管，影响实验的进一步进行，此时归一化相对粘度呈现出先下降后升高的趋势。由图 3-2（b）可知可以看出，当 DMB 浓度为 0.025%、0.030%、0.040%和 0.050%时，归一化相对粘度随着 R 值的增加呈现出先下降后升高再下降的趋势，络合反应呈现出三步骤，分子尺寸呈现出先减小后增大再减小的趋势；当 DMB 浓度为 0.075%和 0.100%时，此时由于 DMB 浓度较大，会形成微凝胶，，堵塞乌氏粘度计的毛细管，影响实验的进一步进行，此时归一化相对粘度呈现出先下降后升高的趋势。由图 3-1（c）可知，当 Sigma 浓度为 0.025%和 0.030%时，随着 R 值的增加，归一化相对粘度基本保持不变，这可能是因为 Sigma 浓度太低，络合反应不明显；当 Sigma 浓度为 0.040%和 0.050%时，归一化相对粘度随着 R 值的增加呈现出先下降后升高再下降的趋势，络合反应呈现出三步骤，分子尺寸呈现出先减小后增大再减小的趋势；当 Sigma 浓度为 0.075%和 0.100%时，此时由于 Sigma 浓度较大，会形成微凝胶，堵塞乌氏粘度计的毛细管，影响实验的进一步进行，此时归一化相对粘度呈现出先下降后升高的趋势。

第 3 章 海藻酸钠与碱土金属离子的络合机理......................23
3.1 引言.....................................................23
3.2 实验材料与仪器设备.......................................23
3.2.1 材料与试剂..............................................23
第 4 章 海藻酸钠与碱土金属离子的临界凝胶行为..................39
4.1 引言.....................................................39
4.2 实验材料与仪器设备.....................................39
4.2.1 材料与试剂..............................................39
第 5 章 混合“蛋盒”模型可能性的探究.........................52

5.1 引言...................................................52

第 5 章 混合“蛋盒”模型可能性的探究

5.1 引言
果胶主要由半乳糖醛酸和一些中性多糖组成，分为“光滑区”和“毛发区”[37]，钙离子络合的结合位点主要集中在光滑区，形成三维网络结构。研究表明，低酯果胶与钙离子之间也能形成“蛋盒”模型，但是这种“蛋盒”模型与海藻酸钠和钙离子形成的“蛋盒”模型有所区别，通常称之为被修饰过的“蛋盒”模型[80]。低酯果胶与钙离子反应时只有较少的二聚作用，没有明显的二聚体形成步骤，也没有二聚体的横向结合[81]。本章利用酸水解法制备高G含量海藻酸钠片段，命名为高G片段（GB）。利用酶解法制备低分子量低酯果胶，命名为（LMP）。采用荧光标记、流变学实验和离子色谱等方法研究在钙离子存在的条件下，GB-DMB和GB-LMP混合“蛋盒”模型的形成。
不同 r[G]GB/([G]DMB+[G]GB)的混合体系在不同钙胶比 R（Ga/G）下的荧光强度变化，如图 5-4 所示，其中 GB 为被荧光标记过的物质，DMB 为没有被荧光标记的物质。图 5-4（a~g）为钙胶比分别为 0、0.25、0.50、0.75、1.00、1.25、1.50，不同 GB 含量下荧光光谱，由图可知在波长为 520 nm 到 620 nm 之间时，其荧光强度随着 GB 浓度升高而升高，最大吸收波长在 531 nm 处。图 5-4（h）为最大吸收波长时不同混合体系在不同钙胶比下的荧光吸收值，由图可知，随着 GB 浓度的升高，其荧光强度呈现线性增加，与钙离子的浓度无关。如果 GB 能够与 DMB 发生混合络合，长链的 DMB 分子会使标记过的短链 GB 分子发生荧光猝灭[24]。因此在低钙区，GB 与 DMB 没有发生交联反应，而是分别和钙离子发生络合。

图 5-5 显示了钙离子诱导的海藻酸钠储能模量对时间的依赖关系，实心组为加入了高 G 片段（GB）的实验组，空心组为没有添加高 G 片段（GB）的对照组。由图可知，在 R=0.6、1.8 和 2.4 时，GB 的加入并不能使体系的储能模量 G′增加，即凝胶强度没有增加。相反 GB 的加入反而使储能模量 G′减小，这是由于钙离子没有达到饱和，GB 占据了部分钙离子，导致与 DMB 络合的钙离子数量减小。由于 GB 分子量较低，对于凝胶强度基本没有影响[22]，因此储能模量会减小。在 R=3.0和 R=3.6 条件下，实验刚开始时实验组的储能模量 G′要比对照组低，这是由于实验组体系中的钙离子在 GDL 的作用下缓释，一开始钙离子浓度要少于对照组，因此其储能模量 G′要小于对照组的储能模量 G′。随着时间的增加，实验组中钙离子完全释放，实验组的储能模量 G′逐渐与对照组一致。随着时间继续增加，实验组的储能模量 G′大于对照组实验，说明 GB 的存在增加了体系的凝胶强度，此时短链的高 G 片段作为交联剂与海藻酸钠反应，使体系的凝胶强度增加。

第 6 章 结论与展望

6.1 结论
本研究以三种不同的海藻酸钠为研究对象，首先对海藻酸钠样品进行分子表征，然后采用相对粘度和圆二色谱法，研究海藻酸钠与不同碱土金属离子的络合机理；同时利用流变实验对海藻酸钠与不同碱土金属离子的临界凝胶行为进行了研究；最后结合荧光标记、流变学实验和离子色谱等方法，研究了在钙离子存在的情况下，高 G 片段和海藻酸钠、果胶混合“蛋盒”模型的形成。得出以下结论：
（1）凝胶渗透色谱-多角度激光光散射仪（GPC-MALLS）和固有粘度两种方法测定的海藻酸钠分子量基本一致。核磁共振结果表明，DMB 样品的 G 单元含量及G 嵌段的平均长度均大于 DM 样品和 Sigma 样品。
（2）海藻酸钠与钙离子和锶离子络合时呈现多步骤，分子尺寸呈现出先减小后增加再减小的趋势；与镁离子不发生络合；与钡离子络合时分子尺寸呈现先增大再减小的趋势。海藻酸钠与锶离子络合形成二聚体的 R 值随着海藻酸钠浓度的升高而降低，最后稳定在 R=0.05，与钙离子有所差异，可能不遵循“蛋盒”模型。钡离子与海藻酸钠络合呈现两步骤，并没有单体复合物和类似“蛋盒”模型的结构形成。
（3）利用葡萄糖酸内酯酸化 M2+-EDTA（M 为 Ca、Sr 和 Ba）溶液，缓慢释放碱土金属离子，研究了不同碱土金属离子引入量时，混合体系的粘弹性。得出在临界凝胶点时，碱土金属离子与羧基的摩尔比分别为 0.15、0.05、0.0125。利用Winter-Chambon 自相似模型、临界凝胶点模量松弛法，并结合标度理论计算临界凝胶指数，发现海藻酸钙和海藻酸钡的凝胶指数与逾渗模型预测的 0.71 基本一致，表明二者的凝胶结构类似于随机形成的电网络结构，适用于标度定律，而海藻酸锶的临界指数与逾渗模型的预测值相差很大，其网络结构的生长不具有完全随机性，不适用于标度定律。

（4）利用酸水解法制备出了高 G 片段，利用酶解法制备出了低分子量低酯果胶 LMP。运用荧光标记、流变学实验和离子色谱手段分别对高 G 片段-海藻酸钠与钙离子的混合络合行为、高 G 片段-低分子量低酯果胶与钙离子的混合络合行为进行了研究。结果表明，在低钙区，高 G 片段与海藻酸钠不存在混合络合行为；在高钙区，高 G 片段会促进海藻酸钠的凝胶。高 G 片段与果胶可能存在混合络合行为。

参考文献（略）

本文编号：42612