SPR生物传感器胰蛋白酶在过敏性休克豚鼠体内含量变化

前 言

过敏性休克是外界抗原性物质进入已致敏的机体后，在短时间内发生的一种强烈的多脏器累及症群，过敏性休克的表现与程度，依机体反应性、抗原进入量及途径等而有很大差别。通常都突然发生且剧烈，若不及时处理，常可危及生命[1]。过敏反应性疾病明显已经成为新型流行病的一种，在全球范围内，严重的过敏反应越来越多，越来越超出人类的承受范围。有流行病学显示每一个美国人的一生中发生过敏反应的可能性约为 3%，死亡率达到 1%[2]，随着社会的发展和工业化的进步，Ι 型过敏反应的发病率正在逐年增加，由过敏反应引发的休克死亡在法医学实践中也愈加常见[3]。I 型变态反应机制通常会诱发过敏性休克性死亡,当然，部分其他类型的免疫学机制也可诱发过敏性休克死亡[4]，不幸的患者不小心，一旦接触了变应原，机体便会迅速出现全身皮肤痰痒、潮红，尊麻疹，血管性水肿，哮喘，呼吸困难，喉头水肿，窒息，血压下降，心律失常，意识丧失，休克甚至死亡[5]。过敏性休克发病无预见性，可在短时间内从轻微的皮肤症状发展到死亡,来势汹汹，因此一直是临床医学的难题，近几年涉及过敏性休克死亡的医疗纠纷也逐年增多。
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1 材料与方法

1.1 实验材料
取多人血清，将其混合离心( 4000 r/min，10 min )后，用无菌生理盐水以1 ：10 的浓度稀释其上清液，取上清液 0.5 mL 注入实验组豚鼠右侧后掌皮内， 于对照组豚右侧后掌皮内注入等量的生理盐水，1.5 min 后，实验组豚鼠出现躁动不安，口鼻流涎，球睑结膜充血，全身抽搐等过敏症状，以上各种症状表明，豚鼠过敏性休克模型建立成功。对照组未见以上过敏症状及其他异常表现。实验组豚鼠免疫 3 周后，取人混合血清上清液 1 mL 注入实验组豚鼠心腔内，诱发过敏性休克死亡。对照组以生理盐水代替混合血清注入豚鼠心腔内，在此过程中，1 只豚鼠死亡，其余对照组豚鼠采用乙醚麻醉致死。每组均取 2 mL 心腔血离心( 4000 r/min,15 min )后，分离血清，-20 ℃冻存备用。

1.2 主要试剂、仪器及器材
巯基十一酸 美国 Sigma—Aldrich 公司
N 一乙基一 N’—(二甲氨基丙基)碳二亚胺 美国 Sigma—Aldrich 公司
N 一羟基琥珀酰亚胺 美国 Sigma—Aldrich 公司
兔抗人类胰蛋白酶单克隆抗体 ( Anti—TPSAB1 )美国 Sigma—Aldrich 公司
乙醇胺 美国 Sigma—Aldrich 公司
醋酸钠 ( pH=5.5，10 mmol/L )自行配置（使用前用 0.22 μm 的膜过滤器进行过滤，避光保存）
PBS 缓冲液 ( pH=7.4 ，0.01 mol/L )自行配置（使用前用 0.22 μm 的膜过滤器进行过滤，避光保存）超纯水

前 言.......10

1 材料与方法...........14

2 对比两种不同的 SPR 检测方法对实验结果的影响 ..............18

3 结果.........20

4 讨论.............28

全文总结..........32

4 讨论

对比两种不同的抗原抗体 SPR 检测方法，以通入方法进行芯片活化、抗体耦联然后通入类胰蛋白酶使其与类胰蛋白酶单克隆抗体结合，实验过程中所需试剂以及样品的量比以滴定方法进行芯片活化、抗体耦联过程中所需的量要多一些，但是 SPR 的检测方法本身就十分节省试剂和样品，所以事实上以通入方法进行实验也并没有浪费试剂和样品，与其他检测方法相比也是节省试剂和样品的方法。从实验结果中可以得出：以通入方式进行芯片活化、抗体耦联与以滴定方式进行抗体活化、抗体耦联两种检测方法均可有效检测血清样品中类胰蛋白酶的 RU 值，且两种检测方法的结果无明显差异。通过研究过敏性休克死亡豚鼠血清类胰蛋白酶的表达，说明过敏性休克时肥大细胞脱颗粒，同时血清中类胰蛋白酶的表达增加并随着脱颗粒弥散到组织间隙，在法医学鉴定中，过敏性休克死者在死亡几小时甚至几十小时内，对血清中类胰蛋白酶的表达并没有很大影响，，另外采取有效的尸体保存方式，检测血清中类胰蛋白酶的含量并不影响其尸检结果。最近，有研究发现在哮喘患者血清中肥大细胞基因（类胰蛋白酶）的表达排前十位，说明不仅是在蛋白质水平，在基因水平都有可能通过检测类胰蛋白酶的表达来鉴定过敏性休克死亡，以后可以在法医学诊断过敏性休克中加以应用。因此，类胰蛋白酶在过敏性休克发生发展过程中有十分重要的作用，我们必须十分关注重视类胰蛋白酶类蛋白物质，研究者在未来应该进一步做有关过敏性休克病人血清中类胰蛋白酶的蛋白质以及基因表达的研究。总之，应用 SPR 生物传感器可以快速有效得检测到过敏性休克死亡血清中类胰蛋白酶表达的增多，可以为以后的法医学诊断、鉴定提供一项新的技术方法，并未后来的研究者提供一种新的思路。
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全文总结

1.过敏性休克死亡血清类胰蛋白酶表达增多。
2.冷冻 3 天的条件下基本不会影响死者血清类胰蛋白酶的含量。
3.过敏性休克死者死后 20 小时左右血清类胰蛋白酶的含量无明显改变。4.SPR 技术可以有效检测血清类胰蛋白酶含量及浓度的变化。5.SPR 生物传感器检测方法的不同不影响检测结果。
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参考文献（略）