IGFBP7基因在K562细胞中的生物学效应及作用机制的探讨

发布时间：2017-12-29 02:29

  本文关键词：IGFBP7基因在K562细胞中的生物学效应及作用机制的探讨　出处：《苏州大学》2012年硕士论文　论文类型：学位论文

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【摘要】：第一部分IGFBP7基因慢病毒载体的构建及其在K562细胞的表达 目的：构建IGFBP7（insulin-like growth factor binding protein7）基因的慢病毒载体，为研究该基因在白血病中的功能提供基础。 方法：采用限制性内切酶酶切获得目的基因，基因重组构建慢病毒载体质粒venus-IGFBP7，用293T细胞包装慢病毒颗粒感染K562细胞，并采用多种方法鉴定。 结果：所获IGFBP7基因经测序与GenBank比对序列一致。慢病毒载体质粒venus-IGFBP7经BamH1酶切鉴定片段大小正确。荧光显微镜及流式细胞仪检测到GFP在293T及K562细胞中表达，RT-PCR和Western blot检测到IGFBP7在K562细胞表达。 结论：本课题成功构建带有IGFBP7基因的慢病毒载体，为研究IGFBP7基因在K562细胞中的功能奠定了基础。 第二部分IGFBP7基因在K562细胞中的生物学功能研究 目的：通过成功构建IGFBP7-K562细胞稳定表达株，观察IGFBP7基因对白血病细胞株K562细胞增殖、细胞周期、穿膜等生物学行为的影响，初步探讨IGFBP7基因在AML中的生物学功能。 方法：通过CCK-8法及细胞集落实验观察IGFBP7对细胞增殖的影响。利用ELISA方法检测稳定转染株培养上清中IGBP7的表达及观察上述细胞培养上清对未转染K562细胞增殖的影响。通过流式分析细胞周期的变化及利用RT-PCR方法和Western Blot方法检测cyclinD1的表达。通过穿膜实验检测IGFBP7基因对K562细胞穿膜能力的影响。 结果：通过cck-8检测发现在第二天igfbp7转染株相对于空载体载体转染组明显升高（升高23%），集落形成数量及大小igfbp7转染组也明显高于空载体组(39±4vs26±6,p0.05)。elisa检测发现igfbp7转染株组细胞培养上清中igfbp7表达水平明显高于空载体组及阴性对照组（76.37±2.19μg/lvs63.52±2.29μg/land60.31±0.24μg/l,p=0.0001）,而且该培养上清具有促进未转染k562细胞增殖的能力（igfbp7转染株上清组vs空载体转染株上清组：14%上升；d2;p0.05）。igfbp7转染株组细胞周期g0/g1期比例下降至35.34%±3.36%，而s期升至56.08%±1.85%，相对空载体转染组具有明显意义（p0.05），同时cyclind1mrna水平及蛋白水平在igfbp7转染组均是升高的。细胞穿膜实验表明igfbp7转染株组穿膜能力较对照组（空载体组及未转染细胞组）明显升高(18080±630vs4250±653vs5388±855；p0.05)。结论：igfbp7基因具有促进细胞的增殖、周期进展及穿膜能力，从而产生癌基因样作用。第三部分igfbp7基因在k562细胞中分子机制探讨目的：为了进一步明确igfbp7在k562细胞中引起的一系列生物学功能变化的具体分子机制，我们通过基因芯片及westernblot方法，从基因组与蛋白组水平来探索的该基因分子效应作用机制。方法：通过基因芯片技术筛选出igfbp7转染株与空载体转染株差异表达基因，利用定量pcr及westernblot技术进一步验证。定量pcr法检测igfbp7和akt3基因在40例初诊急性髓细胞白血病的表达情况，通过相关性分析两基因间的相关性。通过小分子抑制剂进一步观察细胞生物学特征的改变。结果：基因芯片筛选出10个差异表达基因进行定量pcr验证，，，其中包括akt3，结果发现芯片结果与定量pcr结果趋势完全一致，证实了我们芯片结果的可靠性。同样在igfbp7转染株组中akt3总蛋白表达水平及磷酸化水平亦升高。igfbp7和akt3基因在40例初诊急性髓细胞白血病患者中表达量具有明显相关性（r=0.505,p=0.001）。利用akt抑制剂（triciribine）作用转染株后，发现细胞增殖、细胞周期进展及穿膜能力均明显受到抑制，而且akt3磷酸化水平也明显下降，所以我们认为igfbp7在k562细胞中通过活化akt信号通路引起了细胞增殖、细胞周期及穿膜能力的变化。 结论：IGFBP7基因在AML中通过AKT信号通路引起了细胞增殖、细胞周期及穿膜能力的变化。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：苏州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2012
【分类号】：R363

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