人IgE受体蛋白FcεRIα-D2的原核表达及其对IgE的选择吸附能力研究

发布时间：2017-12-29 16:36

  本文关键词：人IgE受体蛋白FcεRIα-D2的原核表达及其对IgE的选择吸附能力研究　出处：《大连理工大学》2012年硕士论文　论文类型：学位论文

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【摘要】：I型变态反应是变态反应的一种,又称速发型过敏反应,是由IgE引起的一种免疫系统疾病,清除过敏反应病人体内过量的IgE对有效缓解和治疗过敏反应疾病具有重要意义。目前药物治疗是治疗过敏反应性疾病的主要方法,这些药物疗法对偶发性过敏反应治疗效果良好,但不能治愈,且会使患者产生药物依赖。由于患者体内致敏原特异性IgE的长期存在是导致顽固性过敏症状不能有效改善的主要原因,因此,采用血液净化吸附剂选择性清除患者血液中的IgE,对于缓解病情将会有很大帮助。已有的吸附剂对IgE的选择性吸附能力较差,且配基属于异源蛋白,脱落容易造成人体的免疫反应。为了提高IgE吸附剂的安全性和选择性,本研究利用人体本身的对IgE具有高选择性的IgE受体FcεRIα为配基,制备了一种对人IgE具有良好选择性吸附能力的吸附剂并考察其对IgE的吸附能力。本论文的研究内容包括以下几个部分： (1)利用基因工程技术,分别构建了重组质粒pET28a-FcsRIa-D2^pET23a-FcεRIa-D2、pCW-ori-FcεRIa-D2和pFLAG-ATS-FcεRIα-D2;考察重组质粒转化表达宿主后对重组蛋白的表达情况,其中E.coli BL21(DE3)-pET23a-FCεRIa-D2的表达量高,达到总蛋白的30%,故将其作为重组蛋白的表达菌株；通过对菌体培养条件的优化,确定了最终的培养条件为：培养温度为37℃,菌体活化过夜后,1%接菌lOOmLLB培养基培养5h,加入0.2mM IPTG诱导4h后停止培养。 (2)重组菌株表达的重组蛋白形成了不溶性的包涵体,本文采用两种复性方法对重组蛋白进行复性：①蛋白透析复性后,进行SEC纯化,复性率达到54.5%。②利用强阴离子交换层析复性同时纯化重组蛋白,复性率达到44.9%。两种方法纯化后的重组蛋白纯度均达到95%,但透析复性所得的重组蛋白对IgE具有较好的结合能力,因此确定透析复性为后续重组蛋白的复性方法。得到的蛋白为可溶性单体,分子量为12.9kDa。 (3)将重组蛋白FcεRIa-D2偶联到固相载体Sepharose CL-4B上,制得吸附剂,通过静态吸附血清中IgE考察了重组蛋白对IgE的结合能力。制备的0.4-4mg/mL配基密度的吸附剂均能选择性去除过敏反应病人血清中约30%的IgE,证明了重组蛋白FcεRIa-D2对过敏反应病人血液中的IgE具有显著的选择性吸附能力。 通过本论文的研究,原核表达并分离纯化了人来源受体蛋白FcεRIa-D2,并将其作为吸附剂的配基,证明了其对人IgE的选择性吸附能力,为利用FcεRIa-D2蛋白治疗过敏性反应奠定了基础。
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【学位授予单位】：大连理工大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2012
【分类号】：R392.1

【参考文献】

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本文编号：1351010