血管内皮细胞生长因子受体-3在血管新生与淋巴管新生中的不同机制研究

发布时间：2018-01-12 05:10

  本文关键词：血管内皮细胞生长因子受体-3在血管新生与淋巴管新生中的不同机制研究　出处：《南京大学》2011年博士论文　论文类型：学位论文

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【摘要】：胚胎发育早期的血管形成主要分为两步：管腔生成与血管新生。管腔生成是指卵黄膜上血岛外的血管内皮细胞祖细胞增殖分化成血管内皮细胞并相互汇聚形成初级血管网,血管新生则是指初级血管网经过重塑形成成熟的具有不同结构的血管网络的过程。血管内皮细胞生长因子受体-3 (VEGFR-3)属于受体酪氨酸激酶(RTK),在该时期高度表达于血管内皮细胞。VEGFR-3在血管新生过程中起重要作用,VEGFR-3基因敲除严重影响早期的血管新生与造血形成过程,小鼠死于胚胎期9.5-10.5天。淋巴管的发育晚于血管的发育,开始于胚胎期10.5天。这时,主静脉管腔中一侧的血管内皮细胞分化成淋巴管内皮细胞并高表达VEGFR-3。在VEGFR-3配体,血管内皮细胞生长因子-C (VEGF-C)的诱导下淋巴管内皮细胞迁移出主静脉,形成与主静脉分离的淋巴囊OVEGF-C与VEGF-D是目前已知的VEGFR-3的配体,但是VEGF-C与VEGF-D基因双敲除的小鼠只有淋巴管发育缺陷,血管发育不受影响,与VEGFR-3基因敲除小鼠的表型不同。这个结果显示VEGFR-3可能存在除VEGF-C/D以外的其他配体,也有可能VEGFR-3在血管内皮细胞中的作用与配体结合没有关系。抑制肿瘤血管新生与病理状态下的视网膜血管新生已成为众多药物的靶点,新生血管被发现表达高量的VEGFR-3,使用VEGFR-3抗体可提高VEGFR-2抗血管新生作用,更多的VEGFR-3抗体目前正在紧张研制中,用于与VEGF抗体(如Avastin(?))的联合治疗。所以,我们认为区分VEGFR-3在血管与淋巴管发育中的不同功能,找出VEGFR-3在血管新生中的作用机制将有助于我们更好的理解VEGFR-3,开发针对VEGFR-3的新药。在本研究中,我们首先建立了VEGFR-3包外配体结合区条件性基因敲除小鼠模型(Vegfr3△LBD)。同时我们也通过实验证实失去配体结合区域的VEGFR-3不能结合VEGF-C。理论上讲,即便存在不为人知的VEGF-C/D以外的VEGFR-3的配体也无法与VEGFR-3结合。在获得纯合子小鼠后(Vegfr3△LBD/△LBD),我们在mRNA与蛋白水平上对VEGFR-3进行了检测,验证了VEGFR-3△LBD的表达。Vegfr3△LBDI/△LBD小鼠表现出较明显的淋巴管发育缺陷,仅能形成淋巴囊,且发育迟缓,形态简单,除此以外其他各器官均无淋巴管形成。原始淋巴囊的形成证明还有微弱的VEGFR-3信号存在,这个信号可能由VEGF-C的另一个受体神经纤毛蛋白-2(Nuropilin-2)或别的因子所介导,详细的机制仍有待研究。无论是在胚胎期10.5天还是胚胎期15.5天,Vegfr3△LBD/△LBD小鼠卵黄膜与胚胎的血管发育均正常,小鼠因淋巴管缺失造成全身积水而死于出生前。该结果提示既然VEGFR-3△LBD可以在血管内皮细胞上行使正常功能,则体内存在VEGF-C/D以外的配体的可能性很小。为了进一步验证我们的假设,我们引入了另一个基因突变小鼠模型-Vegfr3TKmut。该小鼠为ENU突变筛选所得, VEGFR-3蛋白序列中1053位异亮氨酸突变为苯丙氨酸而失去ATP结合能力,造成胞内酪氨酸激酶区功能丧失。由于VEGFR-3TKmut胞外区无突变,所以可以与野生型VEGFR-3形成二聚体并体现出显性抑制效应。Vegfr3+/-小鼠发育正常而Vegfr3+/TKmut小鼠则出现腹水表型,肠道淋巴管发育异常而皮肤则少有淋巴管覆盖。由于该突变的显性抑制作用可降低VEGF-C/VEGFR-3的信号水平,我们检查了Vegfr3+/TKmut小鼠胚胎期,出生后视网膜以及肿瘤的血管新生,我们发现与野生型小鼠相比均无明显变化。为了进一步降低VEGFR-3的信号,我们将Vegfr3+/TKmut小鼠交配并鉴定出Vegfr3TKmut/TKmut小鼠,发现该小鼠完全没有淋巴管生长,也没有淋巴囊形成。该小鼠同样由于严重积水死于出生前后,但血管发育未受影响。上述VEGFR-3功能缺失的小鼠模型向我们展示尽管VEGF-C/VEGFR-3信号通路对淋巴管内皮细胞至关重要,而在血管内皮细胞中则不起作用。VEGFR-3在胚胎期10.5天前高度表达于血管,它的存在是血管新生所必须的,而胚胎期10.5天后则主要表达于淋巴管,所以我们建立了VEGFR-3条件性转基因小鼠,试图使VEGFR-3可以持续的在血管内皮细胞中高表达。该转基因小鼠采用了CAG启动子,在所有组织中均可表达,在没有Cre重组酶的情况下只表达荧光素酶,而在Cre重组酶存在的情况下则可以移除荧光素酶序列,起始VEGFR-3的表达。在将该转基因小鼠与内皮细胞特异性表达Cre的小鼠(TEKCre)交配后,我们在内皮细胞上检测到了外源性VEGFR-3的高表达,同时小鼠死于胚胎期11.5天并伴随着严重的血管新生障碍与贫血表型。这个结果显示虽然VEGFR-3的信号转导作用对血管内皮细胞是不重要的,但是VEGFR-3的存在和适量表达是重要的,过多的VEGFR-3同样会影响血管新生。为了能在细胞与分子水平上进一步了解VEGFR-3在血管内皮细胞中的作用机制,我们引进了表达Tsa58t(SV40)的转基因小鼠,将用于分离表达各种VEGR-3基因改造小鼠的血管内皮细胞。由于小鼠原代血管内皮细胞不易分离且难于培养,我们同时构建了VEGFR-3 WT,VEGFR-3 △LBD以及VEGFR-3TKmut的病毒载体,并在原代分离的人脐带静脉内皮细胞中过表达。我们发现无论哪种形式的VEGFR-3都可以与VEGFR-2结合,降低VEGF-A介导的VEGFR-2磷酸化水平以及下游分子Erkl/2的磷酸化水平。总之,我们通过基因改造小鼠模型证明VEGF-C/VEGFR-3信号通路仅在淋巴管内皮细胞中起作用。在血管内皮细胞中,VEGFR-3很可能与VEGFR-2形成异二聚体从而调控其下游的信号。
[Abstract]:Vascular endothelial cell growth factor receptor - 3 ( VEGFR - 3 ) plays an important role in angiogenesis . The expression of VEGFR - 3 , VEGFR - 3 , VEGFR - 3 and VEGFR - 3 in vascular endothelial cells was observed .

【学位授予单位】：南京大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2011
【分类号】：R363

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本文编号：1412816