激素和SB203580对LPS刺激小鼠肺泡巨噬细胞分泌TNF-α、IL-10的影响及分子机制

发布时间：2018-01-20 03:38

本文关键词： 炎症性肺病 p38MAPK抑制剂糖皮质激素小鼠肺泡巨噬细胞信号转导及转录活化子-3 肿瘤坏死因子-α 白介素-10 脂多糖　出处：《河北医科大学》2012年硕士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：目的：长期以来糖皮质激素（glucocorticoids, GCs）作为重要抗炎药物用于炎症性肺病（inflammatory lung disease, ILD）的治疗。ILD是由于炎症、免疫等各种因素导致肺及支气管内大量巨噬细胞、中性粒细胞等炎症细胞浸润，释放大量炎症介质产生瀑布级联，进而引起肺内炎性介质和抗炎介质失衡造成的肺脏疾病。脂多糖（lipopolysaccharide，LPS），可以通过刺激机体各种免疫细胞产生大量的细胞炎性介质，进而诱发ILD。肺泡巨噬细胞(alveolar macrophages，AMs)是LPS的主要效应细胞，释放内源性炎症因子产生瀑布级联是导致炎症发生、发展的根本原因。信号转导转录激活子-3（Signal transducers and activators of transcription-3,STAT3）的激活在调控ILD起着关键的作用。抑制丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)信号转导通路能减少致炎症细胞因子的释放。本实验以小鼠AM为研究对象，观察激素与p38MAPK特异性抑制剂SB203580对LPS刺激的上述细胞分泌TNF-α、IL-10的影响，分析两者是否存在协同作用并进一步探讨STAT信号途径在其中的作用，为临床应用激素及p38MAPK抑制剂治疗ILD提供理论基础。方法： 1.ELISA检测LPS刺激细胞上清液中的TNF-α浓度。培养MH-S细胞株，调节细胞浓度到1×10~6/ml，于24孔板中培养过夜，随机分组：①对照组：加入与各实验组体积相同的无血清RPMI1640培养液；②LPS+Dex组：终浓度为1×10~(-6)mol/L的DEX预孵育2h后LPS刺激2h、6h、12h；③Dex组：终浓度为1×10~(-6)mol/L的DEX刺激2h、6h、12h；④Dex+SB203580+LPS组：终浓度为1×10~(-6)mol/L的DEX预孵育2h后，终浓度为10μmol/L的SB203580预孵育20min后LPS刺激2h、6h、12h；⑤LPS+SB203580组：终浓度为10μmol/L的SB203580预孵育20min后LPS刺激2h、6h、12h；⑥LPS组：终浓度为100ng/ml的LPS刺激2h、6h、12h。各组细胞刺激成功后取上清液， ELISA测定细胞上清液中TNF-α的含量。 2. ELISA检测LPS刺激细胞上清液中的IL-10浓度。方法及分组同TNF-α测定。 3.免疫细胞化学法检测MH-S细胞中p-STAT3的表达。将MH-S细胞于24孔板中进行爬片，调节细胞浓度到1×106/ml，培养过夜，随机分组：①对照组：加入与各实验组体积相同的无血清RPMI1640培养液；②LPS+Dex组：终浓度为1×10~(-6)mol/L的DEX预孵育2h后，LPS刺激30min；③Dex组：终浓度为1×10~(-6)mol/L的DEX刺激30min；④Dex+SB203580+LPS组：终浓度为1×10~(-6)mol/L的DEX预孵育2h后，终浓度为10μmol/L的SB203580预孵育20min后，LPS刺激30min；⑤LPS+SB203580组：终浓度为10μmol/L的SB203580预孵育20min后，LPS刺激30min；⑥LPS组：终浓度为100ng/ml的LPS刺激30min。各组MH-S细胞刺激成功后，用免疫细胞化学法检测各组细胞中的p-STAT3表达变化。 4.Western blot方法检测MH-S细胞内p-STAT3、STAT3的表达。实验分组同免疫细胞化学法，于6孔板中上述各组细胞刺激成功后收集细胞，检测细胞内p-STAT3、STAT3表达。数据以均数±标准差()表示，各组比较用单因素方差分析(Oneway ANOVA)，各组之间进一步用Student-Newman-Keuls(SNK-q)检验进行两两比较分析是否有显著性差异，P0.05表示有统计学意义。结果： 1.细胞上清液中TNF-α含量的变化：LPS刺激MH-S细胞后，细胞上清液中TNF-α含量在2h已经开始升高，6h达高峰，12h稍下降，与对照组比较差异有统计学意义(P0.05)；DEX预处理后，抑制LPS诱导的TNF-α增加，与LPS组在2h、6h、12h分别比较差异有统计学意义(P0.05)；SB203580预处理后，抑制LPS诱导的TNF-α增加，与LPS组在2h、6h、12h分别比较差异有统计学意义(P0.05)；DEX和SB203580共同预处理后发挥协同作用，进一步抑制LPS诱导的TNF-α增加，与DEX+LPS组在2h、6h、12h分别比较差异有统计学意义(P0.05)，与SB+LPS组在2h、6h、12h分别比较差异也有统计学意义(P0.05)。 2.细胞上清液中IL-10含量的变化：LPS刺激MH-S细胞后，细胞上清液中IL-10含量在2h已经开始升高，6h达高峰，12h已经开始下降，与对照组比较差异有统计学意义(P0.05)；DEX预处理后，抑制LPS诱导的IL-10增加，与LPS组在2h、6h、12h分别比较差异有统计学意义(P0.05)；SB203580预处理后，抑制LPS诱导的IL-10增加，与LPS组在2h、6h、12h分别比较差异有统计学意义(P0.05)；DEX和SB203580共同预处理后发挥协同作用，进一步抑制LPS诱导的IL-10增加，与DEX+LPS组在2h、6h、12h分别比较差异有统计学意义(P0.05)，与SB+LPS组在2h、6h、12h分别比较差异也有统计学意义(P0.05)。 3.免疫细胞化学结果表明：对照组细胞仅见微弱黄染；LPS刺激30min后细胞黄染最强；用DEX预处理后，LPS刺激引起的细胞黄染减弱；用SB203580预处理后，LPS刺激引起的细胞黄染减弱；用DEX和SB203580预处理后发挥协同作用，LPS刺激引起的细胞黄染进一步减弱；用DEX预处理后，未给予LPS刺激细胞微弱黄染。各组与对照组比较p-STAT3表达均显著增高(P0.05)；与LPS组比较，DEX+LPS组、SB+LPS组、DEX+SB+LPS组p-STAT3表达均显著减少(P0.05)；与DEX+LPS组、SB+LPS组比较，DEX+SB+LPS组p-STAT3表达进一步减少(P0.05)。 4. Western-blot检测p-STAT3结果表明：对照组细胞内p-STAT3微量表达；LPS刺激30min后细胞内p-STAT3表达最强；用DEX预处理后，LPS刺激引起的细胞内p-STAT3表达减弱；用SB203580预处理后，LPS刺激引起的细胞内p-STAT3表达减弱；用DEX和SB203580预处理后发挥协同作用，LPS刺激引起的细胞内p-STAT3表达进一步减弱；用DEX预处理后，未给予LPS刺激细胞内p-STAT3表达微弱。各组与对照组比较p-STAT3表达均显著增高(P0.05)；与LPS组比较，DEX+LPS组、SB+LPS组、DEX+SB+LPS组p-STAT3表达均显著减少(P0.05)；与DEX+LPS组、SB+LPS组比较，，DEX+SB+LPS组p-STAT3表达进一步减少(P0.05)。 5. Western-blot检测STAT3结果表明：各实验组细胞内非磷酸化STAT3表达，统计学无显著差异(P＞0.05)。结论： 1. LPS可引起MH-S细胞上清液中的TNF-α和IL-10分泌增加，用DEX、SB203580分别干预后，可抑制TNF-α、IL-10分泌，DEX和SB203580协同抑制TNF-α、IL-10分泌。结果提示p38MAPK抑制剂SB203580可能改善ILD激素抵抗，同激素有协同作用。 2. LPS可引起MH-S细胞磷酸化STAT3表达增加，DEX、SB203580可使磷酸化STAT3表达减少，二者有协同作用。这提示DEX、SB203580可能通过p-STAT3的介导，进而抑制TNF-α、IL-10分泌。 3．上述结果从细胞因子和信号通路方面提示p38MAPK抑制剂SB203580可能改善ILD激素抵抗，同激素有协同作用。
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【学位授予单位】：河北医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2012
【分类号】：R363

【参考文献】