天然钙网蛋白和重组钙网蛋白免疫生物学活性的比较研究

发布时间：2018-01-28 23:45

  本文关键词： 钙网蛋白 多聚体 巨噬细胞 内毒素 免疫原性　出处：《苏州大学》2012年硕士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：钙网蛋白（Calreticulin，CRT）是一种内质网蛋白，由Thomas J. Ostwald等1974年首次从兔的基质网中分离出来。CRT是一个酸性的Ca2+结合蛋白，分子量约为46kD，分为N、P、C三个结构域。N和P连接部位为该蛋白发挥分子伴侣功能的重要区域，C端是一个酸性结构区域，结合有大量的Ca2+，被誉为细胞内的“钙库”。近年来的研究表明，CRT还存在于内质网以外并发挥着重要的生物学功能，诸如参与适应性免疫的抗原加工和递呈、抗肿瘤免疫应答、介导凋亡细胞的吞噬、细胞的粘附和迁移以及免疫细胞的增殖和活化等。 为了进一步研究CRT的免疫生物学活性，我们以新鲜鼠肝作为原材料，利用硫酸铵沉淀和DEAE阴离子交换层析等方法从收集的鼠肝细胞中纯化得到天然钙网蛋白（Native calreticulin, N-CRT）。同时，我们还利用大肠杆菌系统表达了重组钙网蛋白（Recombinant calreticulin, rCRT）,并用Ni+柱对其进行纯化，得到了较高纯度的蛋白。因为rCRT存在较大量多聚体的情况，我们利用凝胶过滤的方法对其进行了分离，得到了rCRT多聚体（PrCRT）， rCRT单体Ⅰ（MrCRTⅠ），rCRT单体Ⅱ（MrCRTⅡ）等三个组分。在此基础上，我们对上述几种成分刺激腹腔巨噬细胞(PMC)的活性进行了研究，发现rCRT和PrCRT具有很强的刺激细胞产生NO、TNF-α和IL-6的活性，而N-CRT、MrCRTⅠ和MrCRTⅡ的活性则相对较弱。鉴于多聚体强烈的功能可能受到原核表达系统中内毒素的污染，我们利用N-CRT研究了其与LPS可能存在的协同刺激活性。结果表明，N-CRT不能和LPS结合，也不具有协同增强LPS活性的功能。 我们还利用N-CRT，，rCRT，PrCRT，MrCRTⅠ，MrCRTⅡ分别免疫了C57BL/6小鼠，分析其刺激小鼠产生抗体的情况。结果表明，N-CRT，MrCRTⅠ，MrCRTⅡ均不能免疫小鼠产生特异性的抗体，而rCRT和PrCRT均能产生高滴度的特异性抗体。 综上所述，我们发现CRT具有刺激巨噬细胞产生促炎症因子的功能，并且PrCRT具有很强刺激功能，这种功能与LPS没有直接关系，在小鼠免疫试验中也证实了这一结果。鼠源的N-CRT以及rCRT单体免疫小鼠均不能产生特异性的抗体，而多聚体则具有极强的免疫原性。这些发现为我们进一步研究CRT的生物学活性提供了有价值的线索。
[Abstract]:Calreticulinine (CRT) is a kind of endoplasmic reticulum protein. In 1974, Thomas J. Ostwald was isolated from rabbit matrix network for the first time. CRT is an acidic Ca2 binding protein with a molecular weight of about 46kD and is divided into N. The three domains. N and P junctions are the important regions in which the protein performs molecular chaperone function. The C-terminal of the protein is an acidic structural region, which binds a large number of Ca2. Recent studies have shown that CRT also exists outside the endoplasmic reticulum and plays an important biological role, such as antigen processing and presentation of adaptive immunity. Antitumor immune response mediates phagocytosis of apoptotic cells adhesion and migration of cells proliferation and activation of immune cells. In order to further study the immunobiologic activity of CRT, we used fresh rat liver as raw material. Native calreticulin was purified from rat hepatocytes by ammonium sulfate precipitation and DEAE anion exchange chromatography. At the same time, we also expressed Recombinant calreticulin (rCRT) with Escherichia coli system. High purity protein was obtained by using Ni column to purify the protein. Because of the existence of a large number of polymers in rCRT, we used gel filtration method to separate the protein. Three components of rCRT polymer PrCRT, rCRT monomer 鈪

本文编号：1471891