抗香港海鸥菌IgY的制备及其应用的初步研究

发布时间：2018-01-31 08:12

本文关键词： 香港海鸥菌卵黄抗体多克隆抗体酶联免疫吸附实验体外抑菌实验　出处：《南方医科大学》2012年硕士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：研究背景：香港海鸥菌(Laribacter hongkongensis, LH),最早在2001年由香港大学微生物学专家Yuen等[1]白一名肝硬化病人的胸腔积脓和血液中分离得到,通过生化特性和16S rRNA基因序列等分析,发现该菌有别于其他细菌种属,属新发现的细菌菌属。2004年香港大学医学院微生物学系Woo等[2,3]发表在国际权威医学杂志《Lancet》上的一项最新研究成果,研究人员通过一个多中心的病例对照研究提出香港海鸥形菌可能与社区获得性胃肠炎和旅行者腹泻有关,有食用淡水鱼与外出旅游的经历是该类腹泻的主要危险因素,研究还提出淡水鱼是香港海鸥型菌的宿主之一。香港海鸥型菌作为一种新发现的食源性病原菌,目前尚未有一套关于该菌检测的标准方法。该菌的检测方法目前主要有细菌分离培养、生化鉴定、PCR鉴定、实时荧光定量检测、环介导等温扩增技术检测等方法[1,4-6],尚未有香港海鸥菌免疫学检测方法的报道。禽类血液中的免疫球蛋白IgG可转移到卵黄液中,并且在胚胎发育过程中对潜在的病原体感染起到被动保护作用[7],这种免疫球蛋白称为卵黄免疫球蛋白--IgY。IgY是存在于鸡卵黄中的主要免疫球蛋白,属多克隆抗体,IgY在疾病的诊断和防治方面具有许多特定优点。通常通过血清途径一次性大量制备抗体是相当困难的,而且多次制备,又导致抗体的均一性差。母鸡一经免疫应答后,可从其卵黄中不断获得特异性的抗体。IgY具有纯度高、特异性强等优点,不与哺乳动物产生交叉血清反应或过敏反应,可作为替代免疫小鼠、兔等哺乳动物所制备的抗体而大量生产。近年来,IgY的研究和应用是免疫学领域的热点和十分活跃的课题。本文用香港海鸥型菌作为抗原免疫蛋鸡制备抗香港海鸥菌卵黄抗体,并对其理化性质、免疫原性、抑菌生物学活性进行了研究,为其今后在诊断和疾病防治方面的应用奠定一定基础。研究目的和内容 1.制备抗香港海鸥菌特异性卵黄抗体。 2.建立直接ELISA法检测LH的初筛方法并对该方法进行评价。 3.初步探索抗香港海鸥菌卵黄抗体的体外抑菌效果。方法： 1.制备香港海鸥菌菌体抗原,腋下肌肉多点注射免疫海兰白鸡,收集免疫鸡蛋,分离提取抗香港海鸥菌卵黄抗体。 2.采用抗原吸收法,饱和硫酸铵分级沉淀法纯化多克隆抗体。 3.间接ELISA法检测抗体效价,用考马斯亮蓝染色法测定蛋白含量,采用SDS-PAGE电泳鉴定抗体纯度。 4.利用上述获得的卵黄抗体结合辣根过氧化物酶标记技术建立检测香港海鸥菌的直接ELISA法。 5.用建立的直接ELISA方法检测草鱼肠道及虎纹蛙肠道分离的标本,评价该方法的灵敏度和特异度。 6.利用液体培养基培养细菌,比浊法检测其抑制香港海鸥菌生长的效果。结果： 1.饱和硫酸铵分级沉淀法纯化抗体,抗体效价可达到1：128000左右；抗香港海鸥菌卵黄抗体对伤寒沙门氏菌、副溶血弧菌存在交叉反应,采用抗原吸收法吸收后,抗体的效价下降至1：8000；卵黄抗体经SDS-PAGE电泳测定,杂带少,纯度较好,条带主要集中于60KD和30KD附近。经考马斯亮蓝染色法得到每毫升的卵黄液中卵黄抗体蛋白浓度为7-10mg。 2.获得的IgY抗体具有良好的热稳定性和酸碱度耐受性。 3.利用过碘酸钠对卵黄抗体进行HRP标记,建立HRP-IgY酶标抗体的直接ELISA法检测香港海鸥菌,封闭时间为60mim,最佳酶标抗体稀释滴度为1：160,阳性检测限为X+3SD=0.181,最低检测限香港海鸥菌浓度为106cfu/ml。 4.利用建立的HRP-IgY酶标抗体直接ELISA法检测自淡水产品肠道分离的细菌,灵敏度为90%,特异度91.5%,为香港海鸥菌检测方法提供新的备选方法。 5.经体外抑菌试验初步证明15mg/ml IgY的抗体浓度对106cfu/ml香港海鸥菌的生长具有抑制作用,其活性及作用机理还有待进一步研究。结论： 1.利用改良水稀释法结合硫酸铵分级沉淀法对卵黄抗体进行分离纯化,得到的抗体纯度和活性良好。 2.利用过碘酸钠对卵黄抗体进行HRP标记,建立HRP-IgY酶标抗体的直接ELISA法检测香港海鸥菌,该方法具有可操作性,为香港海鸥菌的检测方法提供了新的想法和思路。 3.经体外抑菌试验初步证明该抗体对香港海鸥菌的生长具有抑制作用,但其活性及作用机理还有待进一步研究。
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【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2012
【分类号】：R378;R392

【参考文献】