hBax和hHGF双基因共表达慢病毒的构建及其对血管内皮细胞和成纤维细胞的影响

发布时间：2018-02-03 14:56

本文关键词： 慢病毒载体肝细胞生长因子再狭窄　出处：《青岛大学》2012年硕士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：目的包装增强型绿色荧光蛋白标记的表达hBax和hHGF双基因的慢病毒载体,观察慢病毒感染后对内皮细胞和成纤维细胞的影响。方法通过重叠PCR技术和gateway technology技术构建携带目的基因的阳性质粒和仅携带绿色荧光蛋白的阴性质粒并测序,上述两种质粒分别和辅助质粒一同转染293FT细胞包装病毒,利用荧光显微镜来检测病毒滴度。本实验选取人脐静脉内皮细胞(HUVEC)、人胚肺成纤维细胞(HELF)和小鼠胚胎成纤维细胞(NIH3T3细胞)作为研究的目的细胞,利用包装成功的慢病毒感染目的细胞,根据对目的细胞的处理不同,试验分为实验组(感染了携带Bax和HGF双目的基因的慢病毒)、阴性对照组(感染了仅携带有绿色荧光蛋白的慢病毒)和空白组(未做任何处理的正常细胞)3组。RT-PCR和Western blot检测染毒后各组细胞Bax和HGF的表达情况；在倒置显微镜下面观察3组细胞在形态学上所发生的变化；MTT法检测3组细胞间的增殖能力是否有差异,细胞划痕法观察HUVEC染毒后迁移能力的变化。结果经鉴定慢病毒载体质粒构建成功,利用荧光显微镜测得hBax和hHGF共表达慢病毒和仅表达绿色荧光蛋白的阴性病毒滴度分别为7.8×107TU/ml和9x107TU/ml。 RT-PCR和western blot结果显示染毒后使HUVEC表达HGF并且上调了Bax基因的表达(P0.05)。倒置显微镜下可见实验组细胞变为长梭形或者不规则的多角形,细胞表面的突起增多；实验组较之其他两组细胞,其增殖能力和迁移能力都明显的提高(P0.05)。NIH3T3细胞和HELF染毒后,RT-PCR和western blot结果显示实验组与其他两组相比,Bax和HGF的表达明显上调(P0.05)；倒置显微镜下可见阴性对照组的细胞与空白组的细胞生长正常。实验组细胞在染毒72h后,部分细胞发生皱缩,体积缩小;96h后可见有部分贴壁细胞脱落；MTT结果显示实验组较之其他两组细胞,感染hBax和hHGF双基因共表达慢病毒后的上述两种细胞增殖明显被抑制(P0.05)。结论 ①慢病毒包装成功,并且获得了具有较高滴度的慢病毒感染液。 ②Bax和hHGF双基因共表达慢病毒成功感染目的细胞并有效表达,HUVEC染毒后的增殖和迁移能力显著提高。染毒后的NIH3T3细胞和HELF增殖被明显抑制。
[Abstract]:Objective To observe the effect of slow virus infection on endothelial cells and fibroblasts by packaging the slow viral vectors expressing hBax and hHGF double genes . Methods Human umbilical vein endothelial cells ( HUVEC ) , human embryonic lung fibroblasts ( HELF ) and mouse embryonic fibroblasts ( NIH 3T3 cells ) were transfected with 293 FT cells . The expression of Bax and HGF was detected by RT - PCR and Western blot . Results The expression of hBax and hHGF was 7.8 脳 107TU / ml and 9x107TU / ml respectively . The results of RT - PCR and western blot showed that the expression of HGF was increased and the expression of Bax gene was up - regulated in the experimental group ( P0.05 ) . Conclusion ( 1 ) The slow virus packaging was successful and a slow virus infection solution with higher titer was obtained . ( 2 ) Both Bax and hHGF co - expressed lentivirus successfully infect the target cells and effectively express , the proliferation and migration ability of HUVEC were significantly improved after exposure to the virus . The proliferation of NIH 3T3 cells and HELF cells was inhibited significantly .

【学位授予单位】：青岛大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2012
【分类号】：R346

【相似文献】