弓形虫ROP18蛋白对宿主细胞凋亡的影响

发布时间：2018-02-16 09:31

  本文关键词： 弓形虫 ROP18 凋亡　出处：《南华大学》2012年硕士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：目的：研究弓形虫棒状体蛋白ROP18是否与弓形虫抑制宿主细胞的凋亡有关。 方法:利用软件设计扩增ROP18基因的引物，在ROP18基因上游引入Flag标签序列，为方便下游克隆，在上游及下游引物的5’端分别引入BamHⅠ及Hind Ⅲ酶切位点。酚-氯仿法提取弓形虫RH株基因组DNA,，以其为模板PCR扩增ROP18基因。利用试剂盒纯化PCR产物，利用BamHⅠ和Hind Ⅲ双酶切克隆到pcDNA3.1(+)真核表达载体的相同位点，构建pcDNA3.1(+)-Flag-ROP18真核表达载体,DNA序列分析鉴定正确后,大量提取质粒,利用试剂盒去除内毒素，脂质体法转染RAW264.7细胞表达。分离蛋白，SDS-PAGE及利用Flag标签抗体进行Western blotting检测ROP18在RAW264.7细胞中的表达。H2O2分别诱导不含重组质粒的RAW264.7细胞（对照组）、含重组质粒的RAW264.7细胞（转染组）发生凋亡，于24h、48h分别检测以下凋亡指标：细胞爬片经HE染色后显微镜下观察细胞形态的变化，观察细胞是否表现凋亡的特征性形态变化；分离线粒体及细胞浆进行Western blotting检测细胞色素c在线粒体与胞浆中的分布，确定细胞色素C是否从线粒体释放到胞浆；提取细胞基因组DNA进行琼脂糖电泳EB染色后检测DNA是否发生了凋亡特征性的梯状片断化。综合以上实验结果判断弓形虫ROP18蛋白对H2O2诱导的RAW264.7细胞凋亡是否具有抑制作用。 结果： DNA序列分析结果显示正确构建了pcDNA3.1(+)-Flag-ROP18真核表达载体，Western blotting检测到ROP18在RAW264.7细胞中的表达。H2O2诱导转染组和对照组RAW264.7细胞凋亡的结果显示：转染组与对照组RAW264.7细胞形态均出现明显的凋亡特征：细胞变圆，细胞膜皱缩，染色质浓缩；Western blotting检测到细胞色素c在线粒体与胞浆中均有分布，，说明细胞色素c从线粒体转移至胞浆；DNA出现片断化，可见典型的DNA“梯状”条带，表现均表现凋亡特点。 结论: 1.成功构建真核表达质粒pcDNA3.1(+)-Flag-ROP18,该质粒在RAW264.7细胞中表达了微量的ROP18蛋白。 2.本实验中表达的弓形虫ROP18对H2O2诱导的RAW264.7宿主细胞凋亡无抑制作用。
[Abstract]:Aim: to investigate whether ROP18 of Toxoplasma gondii coryloid protein is associated with Toxoplasma gondii inhibiting apoptosis of host cells. Methods: the primers were designed to amplify the ROP18 gene by software, and the Flag tag sequence was introduced into the upstream of the ROP18 gene to facilitate the downstream cloning. The genomic DNAs of Toxoplasma gondii RH strain were extracted by phenol-chloroform method at the 5'end of the upstream and downstream primer, respectively. The ROP18 gene was amplified by PCR. The PCR product was purified by using the kit. BamH 鈪

本文编号：1515201