刚地弓形虫磷酸甘油酸变位酶2基因的生物信息学分析、克隆表达及免疫保护性研究

发布时间：2018-03-06 19:36

本文选题：刚地弓形虫　切入点：生物信息学分析　出处：《山西医科大学》2011年硕士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：实验目的对刚地弓形虫磷酸甘油酸变位酶2(TgPGAM2)基因进行生物信息学分析,并对该基因进行克隆、表达,表达产物纯化后分析其免疫原性;观察重组弓形虫磷酸甘油酸变位酶2蛋白(rTgPGAM2)免疫小鼠诱导的黏膜及系统免疫应答及其抗弓形虫感染的能力,探讨TgPGAM2作为弓形虫疫苗候选抗原的可能性。实验方法第一部分:综述脊椎动物、无脊椎动物、原生动物等不同来源PGAM蛋白的理化性质及研究进展。第二部分:对TgPGAM2基因的主要特性及抗原表位进行生物信息学分析。利用蛋白分析专家系统(ExPASy)提供的ProtParam、SOSUI、TMHMM、HNN、MotifScan,NCBI上的ORF finder、Bcepred等生物信息学在线分析程序,结合Gene Runner、DNAman等生物信息学软件,分析、预测TgPGAM2蛋白的理化性质、可溶性、表面可及性可塑性,跨膜区,翻译后修饰位点、亲(疏)水性、二级结构、抗原表位等。第三部分:构建重组质粒pET30a/TgPGAM2,并在大肠杆菌中高效表达可溶性蛋白。对原核表达的rTgPGAM2进行纯化及免疫原性分析。收集、纯化RH株弓形虫速殖子,提取总RNA;设计合成引物并引入Kpn I和BamH I酶切位点,RT-PCR扩增编码TgPGAM2的基因片段克隆到原核表达质粒pET30a中,阳性克隆经双酶切、PCR及测序鉴定阳性克隆;在大肠杆菌BL21(DE3)中用IPTG诱导表达,表达产物经SDS-PAGE进行鉴定。大量表达rTgPGAM2,以Ni-NTA层析法纯化蛋白,用兔抗弓形虫血清做Western blotting分析其免疫原性。第四部分:观察不同剂量rTgPGAM2滴鼻免疫小鼠诱导的黏膜和系统免疫应答及抗弓形虫感染作用。BALB/c小鼠60只随机分为5组,免疫组分别用10μg、20μg、30μg、40μg rTgPGAM2/只滴鼻免疫小鼠,免疫2次,间隔2周,rTgPGAM2溶于20μl PBS中,对照组用等量PBS滴鼻。末次免疫后第14d,随机取每组5只小鼠,颈椎脱臼处死,检测肠液sIgA和血清IgG、IL-2、IL-4、IFN-γ,分离并计数肠上皮内淋巴细胞(intestinal intraepithelial lymphocytes,IEL)及脾淋巴细胞。其余35只小鼠每只用1×104个速殖子灌胃,观察小鼠健康情况。攻击后第30d,颈椎脱臼处死小鼠,计数肝、脑组织内弓形虫速殖子。实验结果通过生物信息学分析发现,刚地弓形虫PGAM2有10个表面可及性参数≥1.9的区域、3个亲水性参数得分≥1.9的区域、3个柔韧性参数得分≥2的区域、8个翻译后修饰位点、16个潜在抗原表位,可能具有免疫原性。以RH株弓形虫速殖子的cDNA为摸板,扩增获得756bp的TgPGAM2基因片段,并成功构建重组质粒pET30a/TgPGAM2;IPTG诱导后行SDS-PAGE分析,结果表明目的基因在大肠杆菌BL21(DE3)中高效表达,相对分子量(Mr)约30ku。Western blotting显示,纯化后的rTgPGAM2能被兔抗弓形虫免疫血清识别。 30μg组血清IgG(A495=0.9704)、IFN-γ(A405=0.8456),肠液IgA(A495=0.9098)高于20μg组(血清IgG、IFN-γ,肠液IgA A495分别为0.8213、0.7244、0.6504),组间差别有统计学意义(F=8.741, F=4.53, F=6.94,P0.05)。血清IL-2和IL-4组间差别无统计学意义。攻虫后第7～14d,各组小鼠均出现倦怠、活动减少、饮水及采食减少等表现,对照组小鼠死亡2只;40μg组1只。30μg组肝(58.3×10~5/g)、脑(3.99×10~5/g)组织内速殖子虫荷显著低于对照组(肝93.88×10~5/g、脑5.65×10~5/g)和10μg组(肝85.54×10~5/g、脑4.86×10~5/g),组间差别有统计学意义(F=8.56,F=9.31,F=7.39,F=9.68,P0.05)。结论通过生物信息学分析发现,刚地弓形虫PGAM2存在16个潜在的抗原表位,可能具有免疫原性。成功构建重组质粒pET30a/TgPGAM2并在大肠杆菌中高效表达可溶性蛋白。原核系统表达的rTgPGAM2具有免疫原性。30μg组rTgPGAM2滴鼻免疫更有效诱导了黏膜和系统免疫应答,并有效降低弓形虫感染鼠肝、脑组织中的虫荷。本研究的结果表明,刚地弓形虫PGAM2具有免疫原性,并能诱导有效的黏膜和免疫应答,有可能作为弓形虫疫苗的候选抗原。
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【学位授予单位】：山西医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2011
【分类号】：R38

【引证文献】