TLR2、TLR4及相关细胞因子在军团菌感染作用机制的体外实验研究

发布时间：2018-03-08 21:27

  本文选题：TLR2　切入点：TLR4　出处：《山西医科大学》2012年硕士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：目的 ①通过体外实验探讨军团菌活菌刺激对健康人外周血单个核细胞（PBMC）表达TLR2mRNA、TLR4mRNA的影响，初步阐明TLR2、TLR4在军团菌感染过程的作用机制。 ②探讨相关细胞因子（IL-6、TNF-α）在军团菌感染中的作用。 ③探讨TLR4(2244G→A)位点基因多态性与TNF-α和IL-6表达的关系。 方法 ①由太原市红十字血液中心取健康人（n=30）40mL外周血，分离PBMC前保留5mL外周血，以备TLR4 SNP分型检测，密度梯度离心法分离PBMC，台盼蓝染色计数活细胞数，以每孔2×10~6个细胞接种于24孔板，于37℃，5％CO2条件下，培养24 h。 ②培养24h后，将24孔板取出，将健康人PBMC分为正常对照组和军团菌刺激组，军团菌刺激组分别加入500μL2×10~6/mL(MOI1组)、2×107/mL(MOI10组)2个不同浓度的军团菌悬液，3组分别做复孔。37℃, 5%CO2条件下，孵育2h，待军团菌进入贴壁细胞后，弃上清，用1mL磷酸盐缓冲液(PBS)清洗后，加入1mL含10%胎牛血清的RPMI-1640培养液，37℃, 5%CO2条件下培养,分别在18、24、72 h时，收获细胞提取总RNA。各组细胞培养上清液保存于-80℃用于IL-6、TNF-α的检测。 ③采用Real-time RT-PCR法测定TLR2、TLR4、MyD88 mRNA的表达水平。ELISA法检测细胞培养上清液细胞因子（IL-6、TNF-α）表达水平。 ④采用SNaPshot技术进行TLR4 SNP分型检测。 ⑤采用SPSS13.0统计软件进行数据的录入和分析。 结果 ①析因分析结果显示，时间的主效应有统计学意义（F=26.06，p0.05）；时间与浓度的交互作用有统计学意义（F=11.39，p0.05）。18h时,各组之间TLR2mRNA的表达量差异虽无统计学意义(p0.05),但表达量随浓度升高呈现升高趋势；24h时,MOI1、MOI10刺激组TLR2 mRNA的表达量均明显高于对照组(p0.05)，呈现随菌液浓度升高表达量也逐渐升高；72h时，各组之间TLR2mRNA的表达量差异有统计学意义(p0.05)，但呈现随菌液浓度升高表达量反而降低。各浓度之间TLR4mRNA表达差异无统计学意义（F=0.074，p=0.929）；各个时间点差异有统计学意义(F=12.782，p=0.000),分组和时间点之间交互作用差异无统计学意义（F=0.948，，p=0.440）。 ②各时间点IL-6的表达量差异均有统计学意义,(F=8.68，p0.05)呈现随时间延长，IL-6的表达量逐渐升高；对照组和MOI10 IL-6的表达量差异有统计学意义,(F=94.47，p0.05)；时间与浓度的交互作用无统计学意义（F=2.55，p0.05）。各时间点TNF-a的表达量差异均有统计学意义,(F=3.324，p0.05)，呈现随时间延长，TNF-a的表达量逐渐升高；对照组和MOI10 TNF-a的表达量差异有统计学意义,(F=4.511，p0.05)；时间与浓度的交互作用无统计学意义（F=0.283，p0.05）。 ③健康人GA/AA基因型组TNF-α浓度高于GG基因型组，但未出现统计学差异（Z=-1.200, p =0.235）；GA/AA基因型组IL-6浓度高于GG基因型组，但未出现统计学差异（Z=-1.609, p =0.116）。 结论： ①本次研究发现TLR2可能参与抗军团菌感染，TLR4、MyD88尚未发现参与抗军团菌感染。 ②IL-6和TNF-α与军团菌感染有关。 ③GA/AA基因型可能是军团菌感染的保护因素。
[Abstract]:Purpose. 1 to investigate the effect of live Legionella on the expression of TLR2mRNA-TLR4 mRNA in peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) of healthy people in vitro, and to elucidate the mechanism of TLR2mRNA-TLR4 in the process of Legionella infection. 2 to investigate the role of IL-6 TNF- 伪 in Legionella infection. 3 discussion on TLR4(2244G. 鈫扵he relationship between gene polymorphism and expression of TNF- 伪 and IL-6. Method. 1from the Red Cross Blood Center of Taiyuan City, 40 mL peripheral blood of healthy people was collected, and 5 mL of peripheral blood was retained before PBMC isolation for TLR4 SNP typing. PBMC was isolated by density gradient centrifugation, and the number of living cells was counted by trypan blue staining. 2 脳 10 ~ 6 cells per pore were inoculated on 24 well plate. Cultured at 37 鈩

本文编号：1585642